基于膜理論的細胞壓痕力學模型

王 悅 徐獻忠 劉 銘 劉夢云

(鄭州大學力學與安全工程學院，鄭州450001)

細胞是構(gòu)成生物體的基本單位，也是能夠產(chǎn)生力的主動力學系統(tǒng)[1]。在生物體成長的過程中，細胞不停地承受由外部環(huán)境或內(nèi)部環(huán)境引起的力學刺激，并通過改變自己的生物學行為(例如生長、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的改變等)來對這些刺激作出積極的響應(yīng)。當力學刺激超過細胞的適應(yīng)能力時，會導(dǎo)致細胞損傷、病變或死亡。因此，研究細胞的力學性能，對于理解細胞的結(jié)構(gòu)和功能，探索細胞行為內(nèi)在機制具有十分重要的意義。

過去幾十年，許多學者已經(jīng)對細胞的生物力學特性進行了大量的探索研究，特別是單細胞的力學信息越來越受到重視[2-5]。通過對不同種類單細胞的監(jiān)測和實驗，得到形態(tài)結(jié)構(gòu)、物理特性的變化，從而為量化藥物、檢測和識別細胞提供了有價值的見解[6-8]。事實上，在微觀尺度對種類繁多且形態(tài)各異的細胞進行研究是一個較大的難題。隨著科技的發(fā)展和研究的深入，人們建立了一系列實驗方法和力學模型來對細胞的性質(zhì)進行表征。常用的實驗方法有微吸管、光鑷、磁鑷、光學展寬器、原子力顯微鏡等，可以在納米尺度上對單細胞進行操作。力學模型大致分為微結(jié)構(gòu)模型和連續(xù)介質(zhì)模型兩大類，分別從不同角度解釋細胞的力學響應(yīng)，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)學表征。雖然如此，在關(guān)于細胞變形行為的解釋，細胞膜表面的應(yīng)力應(yīng)變分布，不同細胞力學特性參數(shù)的對比等方面，這些實驗?zāi)Ｐ腿匀淮嬖谥T多不足和挑戰(zhàn)。因此，本文基于細胞膜結(jié)構(gòu)理論和細胞壓痕實驗提出了一種可用于分析細胞壓痕實驗中變形的力學模型，并根據(jù)幾何相似性原理，通過宏觀球體壓痕試驗對模型進行了模擬和驗證，從而為單細胞的生物力學研究提供一種新的思路。

1 理論模型

細胞主要由細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核以及其他細胞器組成。當細胞受到力學刺激時，各個組成部分都會產(chǎn)生機械抵抗進而形成整體的力學響應(yīng)。然而，機械力從細胞膜傳遞到細胞質(zhì)、細胞核以及其他細胞器的過程是動態(tài)且復(fù)雜的，目前對其內(nèi)在機制的理解還不夠清晰。

在單細胞力學特性研究中，壓痕實驗是應(yīng)用較為廣泛的測量方法。由于細胞小而柔軟，壓頭或探針常常被設(shè)計成球形，以保證實驗過程中細胞不受到損傷。在對壓痕實驗數(shù)據(jù)進行擬合分析時，Hertz模型形式簡單，應(yīng)用較為廣泛。例如，吳志超[9]用自制的小球探針在液態(tài)環(huán)境下對轉(zhuǎn)移性不同的肺癌細胞進行了納米壓痕實驗，并利用Hertz 接觸方程對實驗結(jié)果進行了非線性擬合，研究了細胞的力學特性參數(shù)對癌變轉(zhuǎn)移的影響；Nguyen等[10]利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)研究了單個軟骨細胞的黏彈性特性，探討了細胞內(nèi)液體對細胞力學響應(yīng)的重要作用。然而，該模型基于一般工程材料的均質(zhì)線彈性和小應(yīng)變假設(shè)，無法充分體現(xiàn)細胞的力學特性，且由于壓痕深度與細胞高度相差不大，數(shù)據(jù)的擬合還會產(chǎn)生較大偏差。由于許多懸浮細胞、剛傳代的癌細胞[11]、軟骨細胞等都呈球狀，可將細胞簡化為一個內(nèi)部充滿液體，外部由不可壓縮、均質(zhì)、各向同性的球形膜包裹的實體。根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)及常用處理方法[12]，我們假設(shè)：(1) 細胞呈球形，變形前后均為旋轉(zhuǎn)對稱體。(2) 細胞膜由不可壓縮、均質(zhì)、各向同性的材料組成，變形前厚度均一。(3)細胞質(zhì)不可壓縮，即細胞體積不變。因此，在本文的細胞模型中，細胞膜的材料屬性是可變的，對于壓痕深度也沒有明確的限制，更貼近于壓痕實驗中細胞的真實情形。

為了模擬細胞的變形，我們首先取出一個微分膜單元(圖1)進行受力分析，柱坐標(ρ,η,?)用來定義膜變形后的形狀[13]。xm和xc是該膜單元的主軸；s是沿著經(jīng)線方向的弧長；θ表示膜表面任意一點的法線與η軸的夾角。Rm和Rc表示主曲率半徑；Tmm和Tcc表示主張力；Tmc是剪切力；σm和σc是膜單元在xm和xc方向上受到的凈剪切應(yīng)力；P是作用在膜單元法線方向上的凈壓力。

圖1 膜單元的受力分析

對于生物細胞而言，其半徑通常遠大于膜的厚度，由板殼理論可知，當膜厚很小時，彎曲剛度對變形的貢獻可以忽略。當微分膜單元平衡時，其在三個垂直獨立方向上的合力為零，即

其中，m，c，n分別表示膜單元在經(jīng)線，緯線以及法線方向上的相應(yīng)分量。代入關(guān)系式dxm=ρd?以及dxc= ds，可得軸對稱膜的平衡方程為

在細胞壓痕試驗中，力通常對稱加載到細胞表面上。此時，σc和Tmc都為零，從而上述平衡方程可以簡化為

其中，Tm和Tc為主張力；Km和Kc為主曲率。主張力依賴于所選擇的表征細胞膜屬性的本征材料，且可以表示為細胞形狀以及材料特性的函數(shù)，主曲率取決于細胞的形態(tài)，因此，求得細胞的形態(tài)變化是描述細胞膜應(yīng)力變化的關(guān)鍵。

圖2 為細胞變形前后的幾何模型示意圖。我們用球坐標(r,θ,ψ)來描述細胞變形前的形狀(細實線部分)，用柱坐標(ρ,θ,η)來描述變形后的形狀(粗實線部分)，根據(jù)幾何關(guān)系可得

式中，γ為球心連線與η軸的夾角；ρB為細胞與基底的接觸半徑；RJ是以J點為球心的球體半徑；ηE是E點在η軸上的坐標距離。壓痕深度(等同于細胞在豎直方向上的整體變形)與細胞結(jié)構(gòu)尺寸之間的關(guān)系可表示為

式中，h為壓痕深度；R為細胞初始半徑；r為球形壓頭半徑。變形前的球形細胞體積為

由旋轉(zhuǎn)對稱可得變形后的細胞體積

其中，V1，V2分別為平面圖形ABCDK與EDGF繞η軸旋轉(zhuǎn)構(gòu)成旋轉(zhuǎn)體的體積；V3為壓頭底部球缺的體積。

圖2 壓痕試驗過程細胞整體變形的幾何模型

根據(jù)細胞體積不變假設(shè)，式(10)與式(11)相等，聯(lián)立式(7)～式(14)即為細胞變形的方程組。在具體條件下給定細胞初始半徑R和壓頭半徑r，求解可得細胞的幾何尺寸變化。

根據(jù)變形前后坐標的定義有

主 曲 率Km和Kc以 及 主 伸 長 比λm和λc可 以 表述如下

其中，撇號在文中均代表對角度ψ的導(dǎo)數(shù)，符號“±”應(yīng)確保相應(yīng)值為正。

在圖2中，施加外力的AB和EL段定義為接觸區(qū)，其他區(qū)域如BC，CD，DE段稱為非接觸區(qū)。對于AB段，接觸面為平面，則需滿足

對于EL段，接觸面為壓頭的球冠，需滿足

由于力平衡，接觸區(qū)的凈壓力P等于零，在式(20)成立的前提下平衡方程式(6)自動滿足，但方程式(5)仍然有效。不考慮壓頭與細胞膜之間的摩擦，也就是σm=0。聯(lián)立方程式(5)和式(6)，式(16)～式(21)，最終可得接觸區(qū)AB段的控制方程為

接觸區(qū)EL段的控制方程為

對非接觸區(qū)有

其中，“+”用于BC和CD段，“?”用于DE段。控制方程式(22)～式(28)中，δ=λcsinψ，f1=?Tm/?λm，f2=?Tm/?λc，f3=Tc?Tm。在具體條件下，給定細胞的材料特性，由細胞的幾何模型計算得到細胞的幾何尺寸，從而確定控制方程的邊界條件及中間點的值，再利用標準四階Runge–Kutta法即可求解得到細胞的變形，細胞內(nèi)的壓力，細胞膜表面應(yīng)力及張力分布等信息。特別的，壓痕力可以表示為

由此可以得到力–變形曲線，不同的細胞屬性將會產(chǎn)生不同的力–變形關(guān)系。

2 球體壓痕試驗

2.1 材料與設(shè)備

在細胞壓痕試驗中，對于細胞變形信息的直接測定是非常困難的，而應(yīng)力應(yīng)變的實時監(jiān)測更是具有挑戰(zhàn)性。相比于微觀的細胞，若能夠在宏觀尺度下進行研究，找到跨尺度的聯(lián)系，就可以在一定程度上降低試驗難度、提高試驗精度，并作為一種補充手段與細胞壓痕相互印證。根據(jù)幾何相似性原理，我們選用彈性良好的乳膠球和聚氯乙烯(PVC)球進行試驗，并在分析部分通過細胞理論模型進行驗證，試驗材料的選擇和加載條件的設(shè)置均可看作是對細胞壓痕試驗的模擬。

實驗設(shè)備有華龍萬能試驗機，靜態(tài)應(yīng)變測試分析系統(tǒng)等。由于在實驗過程中球體所產(chǎn)生的變形遠大于常規(guī)應(yīng)變片的量程，且球面為曲面，無法直接進行測量。為此，我們設(shè)計制作了一種柔性變形傳感器(圖3(a))：(1)將應(yīng)變片焊接于長條狀薄金屬片表面；(2)用強力膠水將彈力線分別粘貼在金屬片兩端，在室溫下靜置一段時間以便膠水固化；(3)制作完成后，利用萬能試驗機對其進行拉伸標定，將應(yīng)變儀采集到的應(yīng)變信號轉(zhuǎn)化成傳感器的變形信息(圖3(b)顯示了其中一組標定結(jié)果)。試驗時，將這種柔性變形傳感器環(huán)繞在球體表面即可監(jiān)測曲面變形。

圖3 傳感器的制作與標定

2.2 試驗過程

球體壓痕試驗共設(shè)置了4 種變量，分別是球體的材料(乳膠或PVC，對應(yīng)于細胞類型)，球體周長(分別為620 mm，640 mm，660 mm，700 mm，對應(yīng)于細胞大小)，加載速率和壓痕深度。試驗中將柔性變形傳感器固定在球體赤道線處，用萬能試驗機分別對每種情況下的球體進行壓痕試驗，利用靜態(tài)應(yīng)變測試分析系統(tǒng)采集試驗過程中的應(yīng)變信號，并將其轉(zhuǎn)化為球體赤道周長的變形信息。圖4(a)和圖4(b)分別為乳膠球(周長700 mm)壓痕試驗和PVC 球(周長640 mm)壓痕試驗。

圖4 壓痕試驗

3 結(jié)果與分析

圖5 給出了不同球體的壓痕曲線(圖例給出了球體的周長)。從圖5 中可以看出，相同的材料，對于同樣大小的壓頭，壓痕力隨球體變大而減小，其原因可能是對于同樣的壓痕深度，較小的球體內(nèi)壓較高，因此需要更大的壓痕力。除此之外，PVC球的壓痕力明顯大于乳膠球的壓痕力，這是因為PVC球的膜較厚(1.25 mm)，其抗拉剛度大于乳膠球膜，PVC球膜從手感上比乳膠球更硬一些，也說明了這一點。

圖5 不同球體的壓痕曲線

在不同的加載條件下，利用Matlab求解球體變形方程組。輸入球體半徑R和壓頭半徑r，計算得到接觸半徑ρB和兩側(cè)球體半徑RJ，再由式(30)可得球體赤道處的理論變形

圖6顯示了周長660 mm、加載速率150 mm/min、壓痕深度60 mm 的乳膠球的理論計算結(jié)果與壓痕試驗測得的球體實際變形。趨勢線的比例系數(shù)和擬合系數(shù)R2表征了理論計算結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)的吻合程度，二者越接近于1，吻合程度越高。從圖6可以看出，理論模型能夠較好地描述該組試驗中球體的變形。經(jīng)過對各組試驗擬合結(jié)果的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，趨勢線的比例系數(shù)取值在0.98～1.01 之間，擬合系數(shù)均在0.99 以上。由此證明本文提出的細胞壓痕理論分析模型可以很好地描述乳膠球和PVC 球的變形行為。

由于細胞的材料屬性呈現(xiàn)高度非線性，不能使用簡單的彈性模量來表征?；诶碚摬糠謱毎ぷ鞒龅木|(zhì)、各向同性及不可壓縮假設(shè)，可用應(yīng)變能密度函數(shù)來表示其本構(gòu)關(guān)系。對于試驗中的乳膠球和PVC球，選用Mooney–Rivlin本構(gòu)模型來描述它們的材料特性[14]，其函數(shù)表達式為

其中，W表示應(yīng)變能；C10和C01是材料常數(shù)，單位與應(yīng)力相同。對于彈性材料，E=6(C10+C01)。I1和I2是應(yīng)變不變量，且可以表示成主伸長比的函數(shù)

膜的主應(yīng)力σi和主張力Ti可由應(yīng)變能密度函數(shù)表示為

其中，t為膜的厚度。將式(35)代入式(22)～式(28)中，根據(jù)幾何模型得到的邊界條件求解。

圖6 球體赤道線的變形隨壓痕深度的變化

對于周長620 mm、壓痕深度70 mm 的乳膠球，模型參數(shù)為C10= 0.23 MPa，C01= 0.19 MPa，t= 0.16 mm，圖7 顯示了球體壓痕力隨壓痕深度變化的實驗數(shù)據(jù)和模擬結(jié)果，較高的吻合度進一步說明了細胞模型的適用性。將材料參數(shù)換算成楊氏模量，則E乳膠=2.52 MPa，EPVC=4.11 MPa。

圖7 球體壓痕力隨壓痕深度的變化

為了驗證宏觀(球體)試驗的有效性，分別將一組PVC 球和幾種細胞的壓痕曲線進行歸一化處理(見圖8，數(shù)據(jù)分別來源于PVC球壓痕試驗和參考文獻)。從圖8中可以看出，PVC球與淋巴瘤細胞[15]、Anip-973 肺癌細胞[9]及軟骨細胞[10]的力學響應(yīng)具有一定的相似性。因此，利用宏觀球體的壓痕試驗去模擬細胞的力學行為是可行的，這種不同尺度下的類比研究方法作為一種補充手段，將會為單細胞的研究提供有價值的信息。

圖8 PVC 球和幾種細胞的歸一化壓痕曲線

圖9 給出了分別運用Hertz 模型和細胞壓痕模型對單個軟骨細胞的壓痕曲線實驗數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果(模型參數(shù)分別為：R= 8.5μm，r= 2.5μm，C10=55.6 Pa，C01=11.12 Pa)。

結(jié)果顯示細胞壓痕模型的擬合系數(shù)R2高達0.999 2，而Hertz 模型的擬合系數(shù)僅有0.993 5，證明了細胞壓痕模型對于軟骨細胞力學特性描述的適用性。Hertz 模型在細胞大變形時忽略了尺寸效應(yīng)，計算結(jié)果表示的是作為均質(zhì)細胞假設(shè)的整體彈性性能，與細胞的真實力學響應(yīng)有一定差別；細胞壓痕模型的計算結(jié)果表示的是細胞膜的彈性性能，比較符合真實的細胞結(jié)構(gòu)及其變形行為。根據(jù)新的模型及計算理論，我們計算了當壓痕深度為2μm時軟骨細胞細胞膜表面的應(yīng)力分布(如圖10所示)。

圖9 兩種模型對單個軟骨細胞壓痕曲線的擬合效果比較

圖10 細胞膜表面的應(yīng)力分布

結(jié)果表明膜表面的應(yīng)力并不均一且在赤道面和壓頭接觸面上有兩個明顯的峰值。由此可以推測，隨著壓痕深度及壓痕力的增大，細胞膜的破裂將會發(fā)生在赤道面或壓頭接觸面上，壓頭與細胞的相對大小決定了破裂的具體位置。

總之，本文提出的細胞力學模型能夠較好地描述壓痕實驗中細胞的力學響應(yīng)，通過對力–變形曲線的擬合能夠得到細胞的力學特性參數(shù)，進一步分析可得細胞膜表面的應(yīng)力分布等。另外，對于模型中細胞的體積限制，只需要加入一個適當取值的系數(shù)即可考慮生物膜的滲透效應(yīng)。

4 結(jié)論與展望

本文基于細胞膜結(jié)構(gòu)理論和細胞壓痕實驗提出了一種細胞力學模型，并通過宏觀球體(乳膠球和PVC 球)壓痕試驗對細胞壓痕進行了模擬，得到了表征不同球體膜力學特性的參數(shù)，驗證了模型的適用性，同時展示出一種可用于細胞壓痕相關(guān)研究的新思路。目前理論模型通過預(yù)測細胞的形態(tài)變化，獲得細胞的材料屬性，進一步分析可以得到細胞膜表面的應(yīng)力分布和細胞內(nèi)的壓強變化等參數(shù)?？傊?，細胞力學特性的研究是一個多尺度跨學科的長期探索過程。由于活細胞的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性和動態(tài)復(fù)雜性，仍然需要加深對不同細胞結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)的認識，并嘗試建立統(tǒng)一的方法和理論體系，為生物材料、醫(yī)學、生命科學等領(lǐng)域的發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ)。