浮游動物DNA宏條形碼標志基因比較研究

高旭，楊江華,*，張效偉,2

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 江蘇省環(huán)境保護化學(xué)品安全與健康風(fēng)險研究重點實驗室，南京 210023

作為一種新型的生物監(jiān)測方法，DNA宏條形碼(DNA metabarcoding)利用環(huán)境DNA序列差異快速、準確和高效地識別物種，適用于從微生物、浮游植物到魚類等各個生物群落，在未來生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中有巨大的應(yīng)用潛力[1-6]。DNA宏條形碼技術(shù)不僅能實現(xiàn)物種有無監(jiān)測，還能通過DNA豐度在一定程度上反映生物量的大小，打破現(xiàn)有以生物個體為主的研究模式，可用于研究環(huán)境脅迫對生物群落的影響，甄別環(huán)境關(guān)鍵污染因子和推導(dǎo)建立地域化環(huán)境基準[7-9]。目前浮游動物DNA宏條形碼技術(shù)仍在發(fā)展階段，尚缺乏統(tǒng)一的操作方法，需要對其(采樣方法、引物選擇和數(shù)據(jù)分析等)進行標準化和調(diào)整，然后才能用于常規(guī)流域生態(tài)監(jiān)測。其中，如何選擇合適的PCR擴增引物是DNA宏條形碼生物監(jiān)測的關(guān)鍵。

DNA宏條形碼主要基于特定標志基因序列差異辨別物種，不同標志基因的物種覆蓋度(coverage)和物種敏感性(sensitivity)存在巨大差異。高敏感性、低覆蓋度的標志基因會導(dǎo)致大量物種的漏檢，而高覆蓋度、低敏感性的標志基因則不能有效地區(qū)分近源物種。因此，選擇合適的標志基因是DNA宏條形碼生物監(jiān)測的基本保障。傳統(tǒng)核糖體18SrDNA基因具有較高的物種覆蓋度，能擴增出包括原生動物、真核藻類、真菌和后生動物[10]在內(nèi)的大部分真核生物類群，但由于基因序列過于保守，物種敏感性較差，難以識別到種水平[11]。細胞色素C氧化酶Ι(cytochrome c oxidase Ι,COI)是最常用的動物標志基因，具有大量條形碼序列積累[12-15]。COI是一個編碼蛋白質(zhì)的基因，存在“第三位密碼子變異(third codon wobble)”，使傳統(tǒng)COI引物在部分物種的鑒定中存在缺陷(taxonomic bias)[16-17]。線粒體12S和16S基因同樣可用于DNA宏條形碼研究[18-19]，但是這2對引物多是為整個真核生物類群設(shè)計的，對浮游動物特異性未知。截至目前，大部分浮游動物研究仍基于18S[10,15,20-22]或28SrDNA基因[1]。Zhan等[23]比較了COI、16S和18S等標志基因在浮游動物條形碼研究中的差異，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)COI引物難以提供穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，建議選擇18S和16S基因進行研究。雖然，Leray和Knowlton[24]在研究魚類腸道浮游動物時設(shè)計了一個更適合高通量測序的COI引物，但其并未就該引物對浮游動物的覆蓋度和敏感性進行深入探討。

除各種通用引物外，學(xué)者們也針對不同生物類群設(shè)計了各種引物，譬如針對底棲動物、魚、浮游植物、昆蟲[25-27]和甲殼動物[1,28]的引物，也有很多引物的初衷是想覆蓋整個真核生物類群[29-30]。對于浮游動物群落來說，究竟何種引物更為合適目前尚未明確。本研究利用Ion Torrent PGM測序平臺比較了3對常見的宏條形碼引物(COI、16S和18SV9)對浮游動物群落表征的差異，探究引物對淡水浮游動物宏條形碼監(jiān)測的影響，從物種檢出、物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)解析等方面分析最適合浮游動物宏條形碼監(jiān)測的引物，為初步建立標準化的浮游動物宏條形碼監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 樣品采集

浮游動物采樣點位如表1所示，分別在2013年4月、8月和11月采集樣品。每個點位用13號浮游生物網(wǎng)濃縮20 L環(huán)境水樣(半定量采樣)，濃縮液現(xiàn)場用冰盒儲存，在實驗室用0.45 μm的濾膜(Millipore, USA)進一步過濾去除水分，過濾后的濾膜裝入5 mL離心管中-20 ℃儲存直至DNA提取。

1.2 浮游動物DNA提取

用E.Z.N.A. water DNA kit (Omega, USA)試劑盒提取濾膜DNA。簡要操作為：將濾膜剪碎后(3 mm大小)裝進5 mL無菌離心管中，加入0.2 mg的直徑為2 mm的玻璃珠(試劑盒提供)，加入1 mL裂解液，用MoBio Vortex-Genie2 (MoBio Laboratories Inc., CA, USA)在最高轉(zhuǎn)速下均質(zhì)5 min后按照試劑盒說明書完成后續(xù)操作。

表1 采樣點位經(jīng)緯度信息Table 1 Basic information of sampling sites

1.3 PCR擴增

PCR擴增體系為50 μL，包含5 μL的10×PCR High Fidelity PCR buffer、2 μL 50 mmol·L-1的MgSO4、1 μL的10 mmol·L-1dNTP mix、0.2 μL的Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA)、2 μL的模板DNA和1 μL的引物(表2)。PCR程序為：預(yù)變性95 ℃、30 s，35個擴增循環(huán)中95 ℃變性10 s、退火30 s(COI為48 ℃，16S為55 ℃，18S為65 ℃)，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用MinElute gel extraction kit試劑盒(Qiagen, CA, USA)進行純化，純化后用Qubit dsDNA HS assay kits (Invitrogen, USA)定量。

1.4 Ion Torrent PGM高通量測序

為了保證樣本獲得大致等量的序列數(shù)(Reads)，所有的PCR產(chǎn)物均被稀釋到10 ng·μL-1的濃度，然后將所有樣點樣品等體積混合在一起?；鞄旌笕?00 ng建庫，用Agencourt AMPure XP kit (Beckman Coulter, Germany)純化測序文庫，去除短片段(<100 bp)，用Ion PGM測序儀(Life Technologies, USA)進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析1.5.1 質(zhì)量控制

測序結(jié)束后用Fastx toolkits將FASTQ文件轉(zhuǎn)為FASTA和QUAL文件[31]。在QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology v1.8.0)[32]中去除低質(zhì)量(Q<20)的序列、錯配序列和長度<150 bp的序列。利用UCHIME[33]識別并去除PCR嵌和子，以上操作均在Bio-Linux 8系統(tǒng)[34]下完成。利用R “Biostrings”包[35]進行序列比對，去除離群序列。

1.5.2 生物信息學(xué)分析

利用UPARSE[36]進行操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)聚類。序列注釋在Statistical Assignment Package軟件中以默認參數(shù)進行[37]，其中，序列相似性>95%且后驗概率>50%的OTU被注釋到物種水平。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同引物的OTU多樣性

隨著測序深度的增加，COI、16S和18SV9檢出的OTU數(shù)量亦不斷增加。當測序深度達到2 000 000左右時，16S引物檢出的OTU數(shù)量趨于飽和，平均每10 000條序列新增1.9個OTU；測序深度達到30 000 000時，COI引物檢出的OTU數(shù)量趨于飽和，平均每10 000條序列新增1.8個OTU；18SV9引物在測序深度達到16 000 000時檢出的OTU才逐漸趨于平衡，增加率為平均每10 000條序列1.2個OTU(圖1)。

圖1 不同測序深度下檢出的操作分類單元(OTU)數(shù)量Fig. 1 The number of operational taxonomic unit (OTU) in different sequencing depth

18SV9引物共檢出超過16 000個OTU，其中有6 891個OTU(占總序列的8.6%)屬于未知序列，最后能夠被注釋的OTU有9 450個(占總序列的91.4%)。僅有1 461個18SV9的OTU隸屬于浮游動物群落，其中，輪蟲438個(占總序列的17.3%)，枝角類159個(占總序列的3.78%)，橈足類864個(占總序列的44.75%)(圖2)。

COI引物共檢出OTU 2 259個，其中有1 669個OTU能夠被注釋(占總序列的93.4%)，這其中浮游動物OTU有1 211個，包括輪蟲729個(占總序列的27.4%)，枝角類235個(占總序列的14.7%)和橈足類246個(占總序列的30.63%)(圖2)。

16S引物共檢出1 277個OTU，其中有390個OTU(占總序列的6.62%)無法確定物種來源，能被注釋的OTU有887個(占總序列的93.4%)，這其中有782個OTU來自浮游動物類群，包括輪蟲548個(占總序列的59.6%)，枝角類235個(占總序列的26.11%)和橈足類46個(占總序列的3.1%)(圖2)。

盡管18SV9引物檢出的總OTU數(shù)量遠大于16S和COI，但其中有大量OTU來自于藻類和原生動物，其檢出的浮游動物OTU數(shù)量與16S和COI引物接近。

2.2 檢出浮游動物種類差異

COI和16S引物檢出的浮游動物物種種類較接近，有64種浮游動物能夠同時被COI和16S引物檢出，有28個物種僅能被COI引物檢出，另有10個物種僅能被16S檢出。18SV9引物獲得的大部分序列都無法注釋到物種水平，因此，在物種檢出上其與COI和16S差別較大，僅5個物種能夠同時被18SV9、COI和16S檢出(圖3)。

圖2 不同引物檢測到的OTU數(shù)和序列Reads組成注：(a)不能注釋OTU比例；(b)不能注釋Reads的比例；(c)OTU組成；(d)Reads組成。Fig. 2 The composition of OTU and Reads in zooplankton metabarcoding with different primersNote: (a) proportion of “unknown” OTU; (b) proportion of “unknown” Reads; (c) composition of OTU; (d) composition of Reads.

圖3 不同引物OTU注釋出浮游動物種數(shù)注：(a)浮游動物OTU數(shù)量和被注釋的等級；(b)檢出物種數(shù)。Fig. 3 The number of zooplankton species detected by different metabarcoding primersNote: (a) the number of zooplankton and the level of taxonomic assignment in each primer; (b) number of species detected by different primers.

COI和16S引物對輪蟲和枝角類檢測結(jié)果的一致性要好于對橈足類檢測結(jié)果的一致性。大部分輪蟲和枝角類都能同時被這2對引物檢出，且物種OTU數(shù)量也較為接近(圖4)。雖然，2對引物檢出的橈足的種類差別不大，但每個物種對應(yīng)的OTU數(shù)卻相差明顯。例如16S引物發(fā)現(xiàn)指狀許水蚤(Schmackeriaforbesi)僅6個OTU，但是COI引物卻發(fā)現(xiàn)其OTU數(shù)量超過30個。類似的情況還出現(xiàn)在湯匙華哲水蚤(Sinocalanusdorrii)和中劍水蚤(Cyclopsp.)中。18SV9引物中除萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)的檢出與COI和16S存在較高的一致性外，其他物種的檢出均與另外2對引物存在較大差異。18SV9中有大量OTU被注釋為鄂足綱(Maxillopoda)，并不能往下細分。

2.3 引物對浮游動物多樣性的影響

COI橈足類多樣性與18SV9橈足類多樣性存在明顯的正相關(guān)(R2=0.4，P<0.05)，而16S橈足類多樣性與COI及18SV9橈足類多樣性之間沒有明顯相關(guān)性。這部分說明，18SV9引物和COI引物能更穩(wěn)定地表征橈足類多樣性(圖5(a)、圖5(b)和圖5(c))。

對枝角類而言，16S引物檢出的枝角類多樣性與COI(R2=0.35，P<0.05)和18SV9存在明顯相關(guān)性(R2=0.43，P<0.05)，但是COI和18SV9之間卻沒有明顯相關(guān)；這表明在物種多樣性的角度上，雖然16S、18SV9和COI引物都能表征枝角類多樣性，但16S監(jiān)測的結(jié)果相對更加穩(wěn)健(圖5(g)、圖5(h)和圖5(i))。

2.4 浮游動物的季節(jié)差異

COI、18SV9和16S都能很好地表征浮游動物群落組成的季節(jié)差異。其中，COI和16S能夠明確區(qū)分3個采樣季節(jié)對浮游動物群落的影響。18SV9顯示8月份的浮游動物組成明顯與12月份和4月份不同，但4月份和12月份間的差別并不明顯(圖6)。宏條形碼監(jiān)測除了能反映季節(jié)差異，還反映了不同水體類型中浮游動物組成的差異，尤其是河流的浮游動物組成與太湖的浮游動物組成存在明顯差異，河流中輪蟲比例更高，而太湖中枝角類和橈足類更為豐富。

3 討論(Disscussion)

3對引物中，18SV9引物具有物種覆蓋度高、測序成本低的特點，更適合種以上水平的物種多樣性監(jiān)測。雖然，18S引物具有很高的物種覆蓋度，但其對浮游動物的擴增特異性較差[11]。盡管本研究的采樣方法已經(jīng)提前對浮游動物進行了富集，18SV9測序中仍有很大一部分OTU來自藻類、真菌和原生生物，說明18SV9引物更加適合原生生物和藻類多樣性研究[38]。此外，18S的V9可變區(qū)長度僅130 bp左右，長度過短可能是物種識別敏感性較差的主要原因。有研究表明，即便是產(chǎn)物長度更長的18SV4高變區(qū)對物種的辨識度也不如同等長度的COI和16S[39]。18SV9測序結(jié)果中大量的OTU僅被注釋到綱，導(dǎo)致物種水平多樣性評估效果并不理想。另一方面，盡管大量18SV9 OTU無法注釋到物種，但是基于OTU依然可以有效地反映季節(jié)和水體類型對浮游動物群落的影響[40]。因此，在不注重物種水平的多樣性時，18SV9引物亦可用于宏條形碼研究，畢竟其更為通用，能覆蓋更多的物種類群，更全面反映整體生物多樣性，且18SV9產(chǎn)物長度短、易于擴增，測序成本更低。

線粒體16S引物具有更高的浮游動物擴增特異性，更適合枝角類和輪蟲多樣性調(diào)查。16S測序產(chǎn)生的OTU大部分都來自浮游動物，說明其對浮游動物具有更好的特異性，使測序結(jié)果更加“高效”和“純凈”，數(shù)據(jù)浪費少，而另外2對引物測序都有相當比例的序列不屬于浮游動物類群。16S引物具有更長的擴增產(chǎn)物(340 bp)，能夠很好地在物種水平上區(qū)分浮游動物。大部分輪蟲和枝角類都能同時被16S和COI所檢出。在16S發(fā)現(xiàn)的782個浮游動物OTU中，來自輪蟲的有548個(占總序列的59.6%)，枝角類235個(占總序列的26.11%)，而橈足類僅有46個(占總序列的3.1%)，對橈足類的檢出效果稍差，會低估水體中橈足類多樣性。

COI引物的擴增產(chǎn)物長度適中，能更加全面、均衡地反映整個浮游動物群落的完整性，為浮游動物宏條形碼研究的理想引物之一。COI作為最常用于動物物種鑒定的條形碼基因[41]，為了能區(qū)別近緣物種，傳統(tǒng)COI引物的擴增產(chǎn)物的長度為648 bp[29]，超出了當前高通量測序的讀長(目前主流的測序平臺也只能穩(wěn)定地測到550 bp左右)，無法用于宏條形碼研究。本研究中使用的COI引物的擴增產(chǎn)物長度為313 bp，在滿足高通量測序讀長要求的同時還兼顧了物種辨識敏感性。COI引物測序中共檢出1 669個浮游動物OTU，其中，輪蟲有729個(占總序列的27.4%)，枝角類235個(占總序列的14.7%)，橈足類246個(占總序列的30.63%)，序列組成上在3個浮游動物群落中比較均衡。COI引物所發(fā)現(xiàn)的物種數(shù)量在3對引物中也是最多的，更為適合浮游動物群落組成的研究。理論上，引物的偏好性是不可避免的，本研究中討論的3種標志基因也都不可能完全覆蓋浮游動物群落的所有物種，需要根據(jù)不同的研究目的選擇合適的引物。在進行探索性多樣性調(diào)查及本底調(diào)查時，可采用多對引物的組合，以盡量檢出更多的物種，豐富物種編目。而進行生態(tài)健康評估或者生態(tài)質(zhì)量評價時應(yīng)選擇某種固定引物(如COI引物)進行調(diào)查，以減少多引物產(chǎn)生的不確定性。

圖5 不同引物檢出浮游動物多樣性間的相關(guān)性Fig. 5 The correlation of zooplankton diversities detected by different primers

圖6 浮游動物群落的季節(jié)差異注：基于OTU數(shù)據(jù)的非度量多維尺度法(NMDS)分析。Fig. 6 The difference of zooplankton community among different seasonNote: Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis was based on the OTU data.