玉米秸稈生物炭對(duì)沉積物中BDE-47生態(tài)毒性的影響

向靜，米盈，田斌，龔雙姣，馬陶武

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

作為水體中各種污染物沉積庫(kù)的沉積物是潛在的二次污染源[1]，而受到持久性有機(jī)污染物污染的沉積物對(duì)水生生物和人類健康具有很大的生態(tài)與健康風(fēng)險(xiǎn)。采用低能耗、高效率和對(duì)環(huán)境干擾小的修復(fù)技術(shù)對(duì)污染沉積物進(jìn)行原位修復(fù)是維持水生態(tài)系統(tǒng)健康的重要手段。通常，對(duì)污染沉積物修復(fù)的主要目標(biāo)是最大程度地降低污染物的生物有效性和生態(tài)毒性。研究證實(shí)，黑炭顆?？梢詮?qiáng)烈地吸附與沉積物結(jié)合的污染物，從而降低污染物的生物有效性、減少生物積累和生態(tài)毒性[2-3]。

生物炭是一種重要的新型碳材料，目前被認(rèn)為是一種重要的綠色環(huán)境吸附劑，在環(huán)境修復(fù)中發(fā)揮重要的作用[4]，因此，將生物炭應(yīng)用于污染沉積物的原位修復(fù)具有很大的潛力[5-9]。關(guān)于生物炭對(duì)水土環(huán)境中污染物阻控的研究主要關(guān)注污染物的生物有效性[10-11]，但在判斷生物炭對(duì)污染沉積物的修復(fù)效力時(shí)僅依據(jù)污染物生物有效性的變化往往是不夠的，必須同時(shí)結(jié)合生物效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)判，因?yàn)槲廴疚锏纳鷳B(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)只有通過(guò)生物效應(yīng)才能得以體現(xiàn)。目前，關(guān)于生物炭對(duì)污染物生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)影響的評(píng)價(jià)研究尚較少報(bào)道[12-13]。銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)是屬于腹足綱田螺科的淡水軟體動(dòng)物，在我國(guó)淡水環(huán)境中廣泛分布，是一種典型的沉積物棲居型底棲動(dòng)物，該物種對(duì)一些典型重金屬和持久性有機(jī)污染物表現(xiàn)出較好的敏感性，是進(jìn)行沉積物毒性測(cè)試的理想生物[14-15]。

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是典型的持久性有機(jī)污染物，PBDEs主要用作阻燃劑，在眾多的PBDEs同系物中，2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)約占PBDEs總量的70%，也是毒性最強(qiáng)的[16]。PBDEs具有高脂溶性，在沉積物中的濃度通常高于水相。例如，我國(guó)珠江沉積物中PBDEs的濃度為12.7～7 361 ng·g-1，水相中濃度為108～5 788 ng·L-1 [17]。

本研究以玉米秸稈制備的生物炭(corn straw biochar, CSB)為研究對(duì)象，以BDE-47為目標(biāo)污染物，以銅銹環(huán)棱螺為測(cè)試生物，采用28 d沉積物生物測(cè)試的方法，研究在BDE-47加標(biāo)沉積物中添加不同比例CSB的情況下，BDE-47在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累、對(duì)其肝胰臟細(xì)胞DNA損傷以及螺體內(nèi)氧化脅迫關(guān)鍵生物標(biāo)志物(活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和丙二醛(MDA)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，考察CSB自身的毒性和CSB對(duì)沉積物中BDE-47生態(tài)毒性控制的效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：真空氣氛爐(GR.TF 80/11，上海貴爾機(jī)械設(shè)備有限公司)；比表面及孔徑分析儀(美國(guó)麥克三站全功能型多用吸附儀3Flex，美國(guó)麥克儀器公司)；熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 400 FEG，美國(guó)FEI公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS-QP2010 plus，日本Shimadzu儀器公司)；熒光顯微鏡(ECLIPSE 80i，日本尼康公司)；多功能酶標(biāo)儀(DTX-880，美國(guó)Beckman Coulter公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；水平電泳儀(DYY-12型，北京六一儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(KE-2000E，上海亞榮儀器有限公司)；玻璃勻漿器；玻璃層析柱。

主要試劑：2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)，分子式C12H6Br4O，CAS# 5436-43-1，純度98.5%，BDE-47標(biāo)樣(50 μg·mL-1)購(gòu)自AccuStandard公司；定量?jī)?nèi)標(biāo)13C12-PCB138(40 μg·mL-1)購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；正壬烷、異辛烷購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司，均為GCS級(jí)；蔗糖、Tris、EDTA-2Na、2,4-二硝基苯肼(DNPH)和鹽酸胍為國(guó)產(chǎn)分析純；正己烷、二氯甲烷、丙酮和甲醇為國(guó)產(chǎn)農(nóng)藥殘留級(jí)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 測(cè)試生物

采用實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)的銅銹環(huán)棱螺作為測(cè)試生物[13]，選取個(gè)體大小一致的健康成體，殼長(zhǎng)為(18.10±1.14) mm，體重為(1.56±0.15) g，用于沉積物暴露測(cè)試。

1.2.2 沉積物

實(shí)驗(yàn)所用沉積物來(lái)自湖南吉首市德夯自然保護(hù)區(qū)，采集與處理方法見(jiàn)Ma等[14]的報(bào)道。

1.2.3 玉米秸稈生物炭制備與表征

CSB采用高純氬氣保護(hù)炭化法進(jìn)行制備。先將玉米秸稈置于烘箱中烘干，粉碎后裝填在管式真空氣氛爐的石英爐管中。炭化前，先對(duì)爐管抽真空，然后通入高純氬氣，重復(fù)3次后，持續(xù)通入氬氣，待管內(nèi)壓力高于1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓后，打開(kāi)排氣口，控制出氣量，使管內(nèi)壓力在整個(gè)炭化過(guò)程中不低于1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定炭化溫度為500 ℃，炭化時(shí)間為8 h。將所制得的生物炭用去離子水反復(fù)淋洗至浸出水呈中性，然后于85 ℃烘干至恒重，取出研磨，過(guò)150 μm尼龍篩，保存?zhèn)溆?。?jīng)分析，在生物炭樣品中未檢測(cè)到BDE-47。對(duì)測(cè)試用生物炭樣品采用比表面及孔徑分析儀測(cè)定其比表面積、平均吸附孔徑和外部表面積等表面參數(shù)，同時(shí)采用熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行表征。

1.3 沉積物生物測(cè)試

根據(jù)我國(guó)水體沉積物中BDE-47的環(huán)境相關(guān)水平設(shè)定BDE-47的實(shí)驗(yàn)加標(biāo)濃度為500 ng·g-1干重[17]。將生物炭設(shè)置3個(gè)添加水平(w/w)：1%、4%和7%。實(shí)驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理組(表1)，用于測(cè)試CSB自身的毒性(處理1～4)和CSB與BDE-47聯(lián)合暴露的毒性(處理5～8)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental set-up

注：CSB表示以玉米秸稈制備的生物炭；-表示無(wú)添加。

Note: CSB stands for corn straw biochar; - means no addition.

參考王萌等[18]的方法對(duì)沉積物進(jìn)行加標(biāo)處理。首先為每個(gè)處理組稱取2 100 g干沉積物(預(yù)先過(guò)150 μm尼龍篩)，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)質(zhì)量的CSB到每個(gè)處理組的沉積物中，然后分別倒入攪拌機(jī)中連續(xù)攪拌至少1 h，轉(zhuǎn)入塑料小桶中。按沉積物和去離子水1∶1的體積比加入去離子水，充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆?。用二甲基亞?DMSO)配制濃度為5 mg·mL-1的BDE-47儲(chǔ)備液，在需要添加BDE-47的處理組加入相應(yīng)質(zhì)量的BDE-47儲(chǔ)備液。每隔3 h用潔凈小木鏟攪拌一次，一次持續(xù)1 h，24 h后完成攪拌。加標(biāo)沉積物在室溫下靜置14 d，在存貯期間，每隔3 d再充分?jǐn)嚢枰淮?，使加?biāo)沉積物達(dá)到理化平衡[19]。將每組處理好的沉積物均分到3個(gè)重復(fù)測(cè)試缸(4 L)中，按沉積物與上覆水1∶4的體積比加入去離子水，然后將所有測(cè)試缸置于一個(gè)水浴控溫水槽中，靜置3 d。暴露開(kāi)始時(shí)，將所選實(shí)驗(yàn)螺隨機(jī)分組，放入每個(gè)測(cè)試缸中，每個(gè)測(cè)試缸15只，每個(gè)處理組共有實(shí)驗(yàn)螺45只，保持光照周期為12 h(白晝)∶12 h(黑暗)，水溫(24±1) ℃，以靜水充氣的方式暴露28 d，對(duì)每個(gè)測(cè)試缸加蓋尼龍網(wǎng)，中間留一個(gè)直徑為5 cm的圓孔，方便喂食。按每只螺每天5 mg的量投喂食料[14]。在整個(gè)暴露期間，每個(gè)測(cè)試缸中實(shí)驗(yàn)螺的存活率都在90%以上，符合沉積物毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)要求。在暴露7、14、21和28 d時(shí)取樣，分3批進(jìn)行，首先從每個(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只，清洗干凈，用鉗子夾破螺尖，取出肝胰臟，立即進(jìn)行DNA損傷測(cè)定；然后再?gòu)拿總€(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只，分離出肝胰臟置于液氮中速凍保存用于生化測(cè)定；最后從每個(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只放入裝有去離子水的潔凈玻璃缸中清腸24 h(以消除腸道中存留的BDE-47對(duì)BDE-47生物積累的影響)，然后分離出全部的內(nèi)臟團(tuán)，保存于-20 ℃冰箱中，用于BDE-47的分析。在暴露實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)未經(jīng)暴露的螺進(jìn)行同樣的取樣處理和測(cè)定。此外，在暴露7、14、21和28 d時(shí)，對(duì)每個(gè)測(cè)試缸進(jìn)行沉積物取樣(50 g)，于2 500 r·min-1離心，過(guò)濾，用于測(cè)定沉積物間隙水中BDE-47的濃度。

1.4 DNA損傷測(cè)定

采用彗星實(shí)驗(yàn)法(comet assay)[20]檢測(cè)肝胰臟細(xì)胞DNA損傷的程度，按照Ma等[21]建立的操作方法進(jìn)行DNA損傷測(cè)定，用熒光顯微鏡進(jìn)行彗星圖像采集，采用CASP軟件進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析，獲取Olive尾距(Olive tail moment, OTM)，OTM為彗星頭部重心與尾部重心間距離與彗尾DNA含量的乘積，對(duì)每個(gè)處理組檢測(cè)3個(gè)樣本，每個(gè)樣本觀察1張載玻片，取50個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)的中位數(shù)作為DNA損傷測(cè)定值。

1.5 生化測(cè)定

1.5.1 ROS的測(cè)定

利用熒光探針DCFH-DA對(duì)新鮮肝胰臟中ROS的含量進(jìn)行測(cè)定。將肝胰臟組織和100 mmol·L-1的磷酸緩沖液(PBS)按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶20的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管，于4 ℃、1 200 r·min-1，離心10 min。先取190 μL上清液加入到黑底酶標(biāo)板中，加入10 μL 1 mmol·L-1的DCFC-DA熒光探針；再取190 μL上清液加入到另一黑底酶標(biāo)板中，加入10 μL PBS，吹打均勻后，于37 ℃孵育30 min，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)(500±15) nm；發(fā)射波長(zhǎng)(530±20) nm)。最后取部分剩余上清液采用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下測(cè)定蛋白含量，ROS含量以熒光強(qiáng)度值(FI)·mg-1蛋白表示。

1.5.2 SOD、GST和MDA的測(cè)定

按照龍奕等[22]的方法進(jìn)行組織樣品的制備和指標(biāo)的測(cè)定。先將冷凍的肝胰臟組織和0.01 mol·L-1Tris-HCl勻漿介質(zhì)(pH 7.4)按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶9的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管，于4 ℃、2 500 r·min-1，離心10 min。先取上清液20 μL(即10%勻漿上清液)，用勻漿介質(zhì)稀釋到1%，用于測(cè)SOD活性；再取上清液220 μL，用于測(cè)GST活性；剩余的勻漿液在10 000 r·min-1繼續(xù)離心20 min，取上清液，稀釋到1%，用于測(cè)定MDA含量。SOD活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測(cè)定，在550 nm下測(cè)吸光度，以50%抑制率的酶量為1個(gè)SOD的活力單位(U·mg-1蛋白)；GST活性采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)法測(cè)定，在340 nm下測(cè)吸光度，活力單位以U·mg-1蛋白表示；MDA含量采用硫代苯巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定，在532 nm下測(cè)定吸光值，活力單位以nmol·mg-1蛋白表示；采用考馬斯亮藍(lán)染色法在595 nm下測(cè)定蛋白含量。

1.6 內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47的分析測(cè)定

按照劉佳等[23]的方法對(duì)冷凍保存的內(nèi)臟團(tuán)樣品和間隙水樣進(jìn)行前處理。以PCB-209作為回收率指示物標(biāo)樣，以13C12-PCB138作為定量?jī)?nèi)標(biāo)。在GC/MS上采用程序升溫的方法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?10 ℃保持1 min，8 ℃·min-1升溫至180 ℃保持1 min，以2 ℃·min-1升溫至240 ℃保持5 min，以2 ℃·min-1升溫到280 ℃保持6 min。質(zhì)譜條件：采用EI離子源進(jìn)行電離，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，燈絲電流0.7 mV，離子掃描模式為SIM模式，接口溫度為300 ℃。全過(guò)程采用方法空白、加標(biāo)空白、基質(zhì)加標(biāo)和基質(zhì)加標(biāo)平行樣進(jìn)行質(zhì)量控制。樣品中PCB-209的加標(biāo)回收率為71%～96%，在合理的回收率范圍(60%～120%)內(nèi)，符合分析要求。儀器對(duì)BDE-47的檢測(cè)限為1.08 ng·mL-1。采用內(nèi)標(biāo)法和校正因子對(duì)BDE-47進(jìn)行定量分析計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后利用單因素方差分析法(ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)法(LSD)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 生物炭表征

對(duì)CSB進(jìn)行了表面積和孔徑測(cè)定，結(jié)果顯示，CSB的比表面積和外部表面積分別為81.66和115.17 m2·g-1，平均吸附孔徑為3.874 nm。CSB的掃描電鏡照片顯示，其外部形貌呈片層狀或者柱狀，孔隙度較高(圖1)。

2.2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度

暴露實(shí)驗(yàn)前和不同取樣時(shí)間點(diǎn)沉積物間隙水中BDE-47濃度的變化如表2所示。在對(duì)照組和生物炭單獨(dú)處理組中均未檢測(cè)到BDE-47。在BDE-47單獨(dú)處理組和CSB與BDE-47聯(lián)合處理組，暴露21 d后，間隙水中BDE-47的濃度有所下降，但差異不顯著，說(shuō)明在暴露實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生物擾動(dòng)對(duì)沉積物化學(xué)特性的影響可以忽略不計(jì)。與BDE-47單獨(dú)處理組相比，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組間隙水的BDE-47濃度均顯著下降，比較暴露28 d后的情況可以看出，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組BDE-47的濃度分別比BDE-47單獨(dú)處理組下降了52%、71%和81%。

圖1 玉米秸稈生物炭(CSB)的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 1 Scanning electron micrograph of corn straw biochar (CSB)

2.3 CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性

將銅銹環(huán)棱螺暴露于單獨(dú)添加不同比例CSB的沉積物28 d后，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各處理組銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)、活性氧(ROS)水平、SOD活性、GST活性和MDA含量均未表現(xiàn)出顯著差異，說(shuō)明CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺不具有毒性。

2.4 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中BDE-47生物積累的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47含量的影響如圖2所示。隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理組的BDE-47含量總體上呈上升趨勢(shì)，添加不同比例的CSB能明顯降低BDE-47的生物積累。在暴露后期(21和28 d)，4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的BDE-47含量不再隨暴露時(shí)間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的BDE-47含量分別比BDE-47單獨(dú)處理組(969.94 ng·g-1)下降了50%、69%和79%。

2.5 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞DNA損傷的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)的影響如圖3所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和CSB比例的增加，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值顯著降低。在暴露后期(21和28 d)，7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值不再隨暴露時(shí)間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值分別比BDE-47單獨(dú)處理組(20.67)下降了44%、67%和83%。

圖2 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47含量的變化注：不同字母表示處理組間存在顯著性差異，P < 0.05；下同。Fig. 2 The change of BDE-47 burden in the visceral mass of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: Different letters show statistically significant differences between treatment groups, P < 0.05, the same below.

表2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度(平均值±SD, n=3)Table 2 The concentration of BDE-47 in the porewaters of the sediments (mean±SD, n=3)

注：同一列數(shù)據(jù)后英文小寫(xiě)字母不同表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)；ND表示未檢出。

Note: Different lowercase letters in the same column of data represent significant differences between different treatment groups (P<0.05); ND is not detected.

圖3 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷的變化Fig. 3 The change of DNA damage in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.6 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞ROS水平的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟ROS水平的影響如圖4所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組。4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平顯著低于1% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組，但4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒(méi)有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平分別比BDE-47單獨(dú)處理組(70.71)下降了29%、40%和41%。

2.7 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞SOD活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性的影響如圖5所示。在暴露初期(7 d)，CSB的影響不明顯；暴露14 d后，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組；在暴露后期(21和28 d)，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性總體上顯著高于BDE-47單獨(dú)處理組。在整個(gè)暴露期內(nèi)，4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒(méi)有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性分別比BDE-47單獨(dú)處理組(13.08 U·mg-1蛋白)升高了9%、17%和21%。

圖4 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟活性氧(ROS)含量的變化注：FI表示熒光強(qiáng)度。Fig. 4 The change of reactive oxygen species (ROS) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: FI stands for fluorescence intensity.

圖5 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig. 5 The change of superoxide dismutase (SOD) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.8 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞GST活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟GST活性的影響如圖6所示。GST活性隨時(shí)間的變化規(guī)律與SOD活性基本相同。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的GST活性分別比BDE-47單獨(dú)處理組(31.68 U·mg-1蛋白)升高了89%、80%和83%。

圖6 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的變化Fig. 6 The change of glutathione-S-transferase (GST) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.9 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞MDA含量的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟MDA含量的影響如圖7所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的MDA含量均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組，但1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒(méi)有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的MDA含量分別比BDE-47單獨(dú)處理組(2.52 nmol·mg-1蛋白)下降了66%、71%和72%。

圖7 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟丙二醛(MDA)含量的變化Fig. 7 The change of malondialdehyde (MDA) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

3 討論(Discussion)

3.1 生物炭的潛在生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)

目前，關(guān)于生物炭生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的研究已有一些報(bào)道。一些研究指出，生物炭具有較低的毒性[24-25]。另有一些研究表明，生物炭不具有毒性，例如，Busch等[26-27]的研究表明水熱法制備的生物炭對(duì)蚯蚓沒(méi)有毒性；韓杰等[28]的研究表明水稻秸稈生物炭對(duì)小鼠不具有毒性。已有研究表明，生物炭的毒性主要與制備工藝和處理方法有關(guān)，相對(duì)較高溫度下(>400 ℃)慢速熱解制備的生物炭通常不具有毒性[29-32]；酸化處理可以降低生物炭的毒性風(fēng)險(xiǎn)[33]。在本研究中CSB都是在較高裂解溫度(500 ℃)下制備的，而且在暴露實(shí)驗(yàn)前都經(jīng)過(guò)酸洗處理，因此不具有毒性。此外，生物炭的毒性還與測(cè)試生物種類有關(guān)[34]。

3.2 生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生物積累的影響

有研究表明，在沉積物或土壤中添加生物炭可以降低有機(jī)污染物的生物積累，而且與生物炭的添加量有關(guān)。Shen等[5]在研究中指出，當(dāng)沉積物中玉米秸稈和馬尾松生物炭的添加量<1.5%時(shí)，搖蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)多環(huán)芳烴的生物積累顯著降低，但當(dāng)生物炭添加量>1.5%時(shí)，對(duì)多環(huán)芳烴的生物積累沒(méi)有影響；Xia等[6]發(fā)現(xiàn)玉米秸稈和柳樹(shù)生物炭可以顯著降低沉積物中全氟辛烷磺酸在搖蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)的生物積累，并且生物炭用量(0.2%～1.5%)越高，生物積累降低越多。Wang等[35]在研究中指出，松木生物炭(400 ℃)雖然能顯著降低土壤中阿特拉津在2種蚯蚓體內(nèi)的生物積累，但當(dāng)生物炭添加量為0.5%時(shí)，阿特拉津在威廉腔環(huán)蚓(Metaphireguillelmi)體內(nèi)的生物積累低于赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)，而當(dāng)生物炭用量為2%時(shí)，阿特拉津在2種蚯蚓體內(nèi)的生物積累沒(méi)有差異。本研究顯示，在沉積物中添加CSB(500 ℃)能顯著降低BDE-47在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累，而且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)CSB添加比例越高，效果越顯著。因此，生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生物積累影響的差異與污染物的種類和濃度、生物炭的制備條件、種類和添加水平以及測(cè)試生物的種類有關(guān)[13]。本研究還顯示，隨著CSB添加比例的增加，沉積物間隙水中BDE-47的濃度顯著下降，從而導(dǎo)致BDE-47的生物積累顯著減少，因此，BDE-47的生物積累與沉積物間隙水中BDE-47的濃度成正相關(guān)，這與Xia等[6]的研究結(jié)果基本一致。

3.3 生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生態(tài)毒性的影響

目前，有關(guān)生物炭與沉積物或土壤中有機(jī)污染物相互作用后對(duì)底棲動(dòng)物或土壤動(dòng)物的潛在生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)研究?jī)H有少量報(bào)道。Bielská等[36]研究了土壤中芒草生物炭與芘相互作用對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)的影響，結(jié)果顯示生物炭可以顯著降低芘對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生態(tài)毒性。Bielská等[12]又進(jìn)一步研究了土壤中木屑和稻殼生物炭與芘、多氯聯(lián)苯(PCB-52)和p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)相互作用對(duì)跳蟲(chóng)(Folsomiacandida)的影響，結(jié)果表明，添加生物炭(1%～5%)可以降低這些有機(jī)污染物對(duì)跳蟲(chóng)的繁殖毒性。本研究通過(guò)考察銅銹環(huán)棱螺的DNA損傷以及氧化脅迫相關(guān)生物標(biāo)志物的變化來(lái)反映沉積物中CSB對(duì)BDE-47生態(tài)毒性的影響。細(xì)胞DNA損傷和氧化脅迫的生物標(biāo)志物通常可以有效指示污染物的生態(tài)毒性[13,22]。當(dāng)生物機(jī)體受到外源性化學(xué)物質(zhì)脅迫時(shí)，作為機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)重要組分的SOD可以降低或消除氧化脅迫以維持ROS的平衡，但過(guò)多的ROS則會(huì)激活或抑制SOD活性；MDA水平是衡量機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞氧化損傷的程度；GST是一種在機(jī)體Ⅱ代謝中參與親電性化合物解毒的關(guān)鍵酶，它同時(shí)也參與細(xì)胞的抗氧化防御，污染脅迫時(shí)GST活性的改變體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)污染物的生物轉(zhuǎn)化和抗氧化功能；機(jī)體細(xì)胞DNA在ROS的攻擊下容易發(fā)生氧化損傷。結(jié)果表明，沉積物中不同比例的CSB與BDE-47的聯(lián)合暴露能夠顯著降低銅銹環(huán)棱螺肝胰臟的DNA損傷和ROS水平，顯著減少對(duì)SOD和GST活性的抑制，顯著降低MDA含量，這說(shuō)明不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著。從變化趨勢(shì)來(lái)看，DNA損傷隨著CSB添加比例的升高而顯著降低，但不同添加比例的CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間的ROS水平、SOD活性、GST活性和MDA含量沒(méi)有顯著差異，也就是說(shuō)，BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降，這可能是由于不同CSB添加比例引起的聯(lián)合處理組中BDE-47生物積累的差異并不足以引起氧化脅迫生物標(biāo)志物響應(yīng)的改變，這與銅銹環(huán)棱螺對(duì)BDE-47脅迫的響應(yīng)相對(duì)較慢有關(guān)[15]。

綜上所述，在慢性暴露情況下，本研究所制備的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺不具有毒性。CSB通過(guò)顯著降低沉積物間隙水中BDE-47的濃度而降低其在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(1%～7%)，CSB添加比例越高，降低BDE-47生物積累的效果越顯著。不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性(DNA損傷)，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著，但BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降。因此，從降低沉積物中BDE-47生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的角度來(lái)說(shuō)，沉積物中CSB的合適添加比例為4%。