死亡黃牛脾肺組織中病原菌的分離與敏感藥物篩選

劉亞欣，王 宇，楊 諾，郭桂英，李 遷，曾紀(jì)鋒，鄭繼平*

（1. 海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 海南大學(xué)教務(wù)處，海南 ?？?570228；3.海南大學(xué) 網(wǎng)絡(luò)與技術(shù)中心，海南 ?？?570228；4. 海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海南 ?？?570228）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）在分類學(xué)上隸屬腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬，其分布廣泛，除了自然界，還存在于人和動(dòng)物腸道[1]，是醫(yī)院內(nèi)感染條件性致病菌之一，可引起宿主傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、肺炎及敗血癥等[2]。有大量文獻(xiàn)報(bào)道了陰溝腸桿菌在醫(yī)院臨床的分離與耐藥性分析，另有研究表明陰溝腸桿菌也是誘導(dǎo)人體發(fā)胖的主要病原之一[3]。但其對(duì)動(dòng)物的感染卻鮮有報(bào)道。也有研究表明陰溝腸桿菌可引起大熊貓、綿羊、藍(lán)孔雀、雞、亞洲黑熊出現(xiàn)呼吸道感染、肺炎、出雛率下降和死亡等癥狀[4-8]。

黃牛是中國(guó)固有的普通牛種。角短，皮毛黃褐色或黑色，用來(lái)耕地或拉車，皮可制革，其肉質(zhì)鮮嫩，具有低脂肪高營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，其飼養(yǎng)地區(qū)幾乎遍布全國(guó)。作為我國(guó)的一種土著性物種，黃牛一般具有比進(jìn)口奶牛等物種更強(qiáng)的免疫抗性[9]，因此有關(guān)陰溝腸桿菌感染黃牛的報(bào)道十分罕見(jiàn)。本研究對(duì)2018 年5 月?？谑胁⒋迥仇B(yǎng)牛場(chǎng)一頭明顯營(yíng)養(yǎng)不良死亡黃牛的脾肺組織樣品經(jīng)病原分離發(fā)現(xiàn)主要為陰溝腸桿菌感染。本研究為該地區(qū)黃牛養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)疾病防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、培養(yǎng)基及主要試劑 BALB/c 小鼠30 只，體質(zhì)量20±2 g，雌雄各半，購(gòu)自海南藥物研究所。

腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基、藥敏紙片，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix、2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒、DL2000 DNA Mark?er，均購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 死亡黃牛組織病料樣品采集及細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌采集死亡黃牛的肺臟、脾臟，用無(wú)菌接種環(huán)采集死亡黃牛脾肺樣品分別劃線接種于BHI 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落劃線接種于普通斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后經(jīng)革蘭染色和鏡檢。

1.3 分離菌的生化特征鑒定 取純培養(yǎng)后的分離菌，分別接種于糖發(fā)酵管、葡萄糖蛋白胨等培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h 觀察結(jié)果，依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

1.4 分離菌16S rRNA 基因的擴(kuò)增及其序列分析按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取分離菌基因組DNA，以其為模板，采用16S rRNA 通用引物（F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/F2: 5'-GG TTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，PCR 產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank 中相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性分析，并利用MEGA7.0.26 構(gòu)建該基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 小鼠感染性試驗(yàn) 將BALB/c 小鼠隨機(jī)分為6組，每組5 只，取細(xì)菌純培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，測(cè)定并調(diào)整細(xì)菌濃度到1×1010cfu/mL后，10倍倍比稀釋成5個(gè)濃度（109cfu/mL～105cfu/mL），腹腔接種0.3 mL/只，對(duì)照組注射無(wú)菌PBS 0.3 mL/只。接種后連續(xù)觀察7 d，每天記錄小鼠死亡情況，計(jì)算分離菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50），同時(shí)剖檢死亡小鼠，采集病變部位再次進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.6 分離菌的藥敏試驗(yàn) 按照Kirby-Bauer（K-B）紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)12 種常用抗菌藥物的敏感性。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS1994）推薦標(biāo)準(zhǔn)判斷抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 病料樣品的細(xì)菌分離結(jié)果 病死黃牛的脾臟、肺臟樣品劃線培養(yǎng)在BHI 培養(yǎng)板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)兩個(gè)樣品在BHI 培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)有相同的圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)呈露珠狀、中央隆起、乳白色，直徑約為1.0 mm 的菌落（圖1A），挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，可見(jiàn)呈單個(gè)或成簇排列的淡紅色短桿菌（圖1B），表明分離菌為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 分離菌的生化鑒定結(jié)果 隨機(jī)挑取5 個(gè)單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)把菌株命名為CS01、CS02、CS03、CS04、CS05，對(duì)純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果顯示，5 株菌均可分解利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等糖類（表1），表明該菌屬于腸桿菌科。對(duì)照腸桿菌科生化鑒定手冊(cè)初步判斷其為陰溝腸桿菌。

圖1 分離菌的形態(tài)（A）及染色鏡檢（B）結(jié)果（100×）Fig.1 Gram staining(A)and morphology(B)of the bacterial isolate(100×)

表1 分離菌生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test of the bacterial isolates

2.3 分離菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增及其序列分析結(jié)果 以提取的CS01 菌的基因組為模板，進(jìn)行16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增，PCR 測(cè)序結(jié)果輸入NCBI中進(jìn)行核酸比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌CS01 與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（KM401861.1）的 同 源 性 達(dá)100%；構(gòu)建的16S rRNA 基因進(jìn)化樹(shù)顯示，該菌與陰溝腸桿菌位于同一分支（圖2）。上述結(jié)果進(jìn)一步表明CS01 菌株為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。

本研究首次在黃牛中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌感染。死亡黃牛的臨床癥狀顯示，該死亡黃牛極度消瘦且體色暗黃，呈明顯的營(yíng)養(yǎng)不良特征，表明引起該次黃牛陰溝腸桿菌感染的死亡與死亡黃牛的自身免疫力低下密切相關(guān)。同時(shí)也提示陰溝腸桿菌除了感染人、大熊貓、藍(lán)孔雀、水產(chǎn)動(dòng)物以外[10-12]，在海南氣候高溫多濕，易于各種病原滋生的不良環(huán)境條件下，其對(duì)黃牛也會(huì)造成感染。

圖2 分離菌株16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Cladogram based on the Enterobacter cloacae 16S rRNA sequence

2.4 小鼠感染性試驗(yàn) 將分離得到的陰溝腸桿菌CS01 株稀釋成109cfu/mL～105cfu/mL 5 個(gè)不同濃度分別接種小鼠，依次是實(shí)驗(yàn)組1～實(shí)驗(yàn)組5，24 h 后，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 的小鼠行動(dòng)緩慢，震顫，飲水量和進(jìn)食量減少，繼續(xù)觀察7 d，實(shí)驗(yàn)組1 小鼠死亡5 只，實(shí)驗(yàn)組2 小鼠死亡2 只，實(shí)驗(yàn)組3 和4 均死亡1 只，實(shí)驗(yàn)組5和對(duì)照組無(wú)死亡小鼠。按照Bliss 法計(jì)算，得出該陰溝腸桿菌對(duì)小鼠的LD50為9.60×107cfu/mL。

栗海軍等從亞洲黑熊體內(nèi)分離的陰溝腸桿菌對(duì)小鼠的LD50為7.94×108cfu/mL[7]，相比較而言，本實(shí)驗(yàn)分離到了致病力更強(qiáng)的陰溝腸桿菌。剖檢死亡小鼠，可見(jiàn)其肺臟充血腫大，脾臟出血。對(duì)死亡小鼠病變部位進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果得到了與CS01 菌株形態(tài)、生理生化特征均一致的菌株，表明再次分離到了陰溝腸桿菌CS01 株。根據(jù)細(xì)菌分離鑒定和小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果，確定導(dǎo)致該黃牛死亡的病原菌為陰溝腸桿菌。因此，加強(qiáng)對(duì)黃牛的飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)黃牛體質(zhì)是控制該菌感染的必要措施，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該類條件致病菌的監(jiān)測(cè)與防治。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，分離的陰溝桿菌對(duì)12 種抗菌藥物均有不同程度的敏感性，按照其藥物敏感性強(qiáng)弱排列依次為諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星，林可霉素；對(duì)新霉素、四環(huán)素、阿莫西林、米諾環(huán)素、多黏菌素B、丁胺卡那霉素中度敏感，對(duì)青霉素和復(fù)方新諾明耐藥（表略）。諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星屬于第三代氟喹諾酮類新藥，對(duì)陰溝腸桿菌確實(shí)有顯著的效果，但應(yīng)注意合理使用，避免濫用藥物導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象發(fā)生。但該結(jié)果不同于其他地區(qū)獸醫(yī)類陰溝腸桿菌的耐藥譜[7]，分析原因可能是由于養(yǎng)殖區(qū)所處地域的不同和使用抗生素的習(xí)慣不同造成的。該藥敏試驗(yàn)結(jié)果為該地區(qū)黃牛養(yǎng)殖業(yè)合理選用抗菌藥物提供參考依據(jù)。

利用抗菌藥物治療有利有弊，有利的一面是見(jiàn)效快，使用方便；不利的一面是濫用抗菌藥物會(huì)使病原菌對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。鄧凱偉研究了不同中草藥復(fù)方組合對(duì)陰溝腸桿菌的抑制作用，結(jié)果表明石榴皮提取物、白頭翁提取物組合有較好的體外抑菌效果[13]。

由于本實(shí)驗(yàn)是從黃牛脾肺組織分離出陰溝腸桿菌，可能是由于該菌感染黃牛呼吸道所致，對(duì)于黃牛這種圈養(yǎng)動(dòng)物，一方面可能是由于工作人員頻繁出入飼養(yǎng)環(huán)境，不注意周圍衛(wèi)生，二是沒(méi)有注意黃牛本身的營(yíng)養(yǎng)，致使其免疫力低下，才導(dǎo)致陰溝桿菌的感染。因此，外部環(huán)境的清潔、規(guī)律的消毒、合理使用抗生素以及開(kāi)發(fā)中藥制劑是黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。