CVC1302 對O 型口蹄疫病毒細菌樣顆粒疫苗的免疫增強作用

侯立婷，陳 瑾，于曉明，喬緒穩(wěn)，張元鵬，鄭其升*，侯繼波*

（1. 江蘇省農業(yè)科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouse disease virus，FMDV）引起的偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播途徑多、速度快，是危害畜牧業(yè)最嚴重的傳染病之一[1]。該病曾多次在世界范圍內發(fā)生大流行，國際獸醫(yī)局將其列為必須通報的烈性傳染病[2]。FMDV病毒粒子無囊膜，衣殼由VP1、VP2、VP3、VP4 4種結構蛋白組成，其中VP1 蛋白暴露在病毒粒子表面，含有可誘導感染動物產生中和抗體的主要抗原表位，是FMD 新型疫苗研究最多的結構蛋白[3-5]。研究發(fā)現O 型FMDV 的5 個抗原位點中有3 個位于VP1結構蛋白上，主要的B 細胞表位為aa141～aa160，其能夠誘導機體產生體液免疫應答[6]。兩個輔助性T細胞表位分別為T1（aa21～aa35）和T2（aa200～aa213），其能夠增強Th 細胞的活性，并同時協同誘導機體產生抗病毒抗體[7]。本實驗前期選取FMDV VP1 結構蛋白上的B、Th 細胞表位進行亞單位疫苗的設計，利用實驗室可溶性表達平臺進行蛋白的可溶表達，利用革蘭氏陽性增強基質（GEM）表面展示系統對其進行純化，構建了細菌樣顆粒（Bacterial like parti?cles，BLP）疫苗GEM-B（T1BT2）4B[8]。GEM 表面展示系統由GEM 顆粒和蛋白錨鉤（Protein anchor，PA）構成，研究證實，與PA 融合表達的目標蛋白可以展示在GEM 顆粒的表面，以GEM 為骨架形成BLP抗原。GEM 顆粒易于保存、穩(wěn)定性好、可以刺激機體產生強烈的免疫應答，并且該系統操作簡單[9-11]。

免疫增強劑CVC1302（ZL 201310042983.0）是由國家獸用生物制品工程技術研究中心免疫技術研究室自行研制，該增強劑經過大量實驗證明，可以顯著提高各類FMD 疫苗免疫效力，而且能夠延長抗體的持續(xù)期[12]。本實驗將免疫增強劑CVC1302 與GEM-B（T1BT2）4B 混合乳化制成疫苗，免疫小鼠和仔豬，通過評價其免疫效力，為FMD BLP 疫苗的研制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 BLP 疫苗GEM-B（T1BT2）4B 及表達用載體pQZ-PA，由本實驗室構建制備[8]；MTT、PHA 購自南京生興生物科技有限公司；4 周齡的ICR 小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心；45 日齡FMD 抗體陰性仔豬，由國家獸用生物制品工程技術研究中心試驗豬場提供；FMDV VP1 ELISA 試劑盒購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司；O 型FMD 液相阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所；商品化FMD 合成肽疫苗[批號：（2014）090297522]由國家獸用生物制品工程技術研究中心提供；佐劑為實驗室自購的白油、司本、吐溫；免疫增強劑為CVC1302 由本實驗室購買、配制。

1.2 動物分組與免疫

1.2.1 小鼠免疫實驗 4周齡的ICR小鼠50只，隨機劃分為5 組，每組10 只，分別標記為A、B、C、D、E組。A 組 為GEM-B（T1BT2）4B 組；B 組 為GEM-B（T1BT2）4B與免疫增強劑CVC1302配合使用組；C組為pQZ-PA 轉化的E. coli 對照組；D 組為PBS 空白對照組；E組為商品化FMD合成肽疫苗對照組。

免疫增強劑CVC1302（50 μg/只）先與GEM-B（T1BT2）4B 混合再與白油佐劑按1∶2 乳化制苗。以0.2 mL/只皮下多點注射進行免疫，免疫后21 d 加強免疫一次，分別于免疫后的21 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d 采集血清用于FMDV VP1 結構蛋白抗體檢測。

1.2.2 豬免疫實驗 45 日齡FMD 抗體陰性仔豬50頭仔豬隨機劃分為5 組，每組10 頭，分別標記為I、II、III、IV、V 組。I 組 為GEM-B（T1BT2）4B組； II 組 為GEM-B（T1BT2）4B 與 免 疫 增 強 劑CVC1302 配合使用組；III 組為pQZ-PA 轉化的E.coli對照組；IV 組為PBS 空白對照組；V 組為商品化FMD 合成肽疫苗對照組。

免疫增強劑CVC1302（1 mg/頭）先與GEM-B（T1BT2）4B 混合后，再與白油佐劑按1∶2 混合乳化制苗。采用肌肉注射的方式進行免疫，免疫劑量為2 mL/頭，免疫后28 d 加強免疫一次，分別于0、28 d、56 d 采集血清用于液相阻斷抗體ELISA 檢測。1.3 血清IgG 抗體檢測 按照免疫程序采取小鼠及仔豬血清，分離后的血清按照FMDV VP1 結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試劑盒和O 型FMD 液相阻斷抗體ELISA 檢測試劑盒說明書測定其血清抗體。

1.4 小鼠淋巴細胞增殖檢測 免疫后第35 d，每組隨機取3 只免疫小鼠，采用斷頸方式迫殺，先用0.5%新潔爾滅溶液對小鼠全身進行消毒，再用75%酒精消毒。無菌采取小鼠脾臟，分離淋巴細胞，用含10%（v/v）新生牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液調整細胞濃度約為2×107個/mL，加入96 孔細胞板內，100 μL/孔，每個樣品做3 個重復，向各孔內加入5 μg 人 工 合 成 的 豬O 型FMDV GH loop 表 位 多 肽（VP1 aa141～aa160 位AA）作為刺激抗原，同時設PHA 作為陽性對照組，2 μg/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，每孔加入5 μg/mL 的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。測定OD490nm值，取3 個平均值計算刺激指數（SI），試驗設不加FMD 抗原的營養(yǎng)液作為陰性對照。以SI 作為判斷淋巴細胞轉化程度的參數，SI=刺激孔OD492nm值/陰性對照孔OD492nm值。

1.5 小鼠細胞因子檢測 免疫后第35 d，每組隨機取3 只免疫小鼠，采用斷頸方式迫殺，取相同質量的免疫小鼠脾臟研磨，反復凍融3 次，用TRIzol 裂解法提取RNA，利用一步反轉試劑盒獲得cDNA。根據GenBank 中登錄的相關序列設計引物（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，參考文獻[13]的方法利用熒光定量PCR 檢測小鼠脾臟中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的基因轉錄水平。

表1 實驗用引物序列Table1 Primers used in this study

2 結 果

2.1 FMDV VP1 結構蛋白特異性抗體檢測 利用FMDV VP1 結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試劑盒檢測免疫增強劑CVC1032 的免疫增強作用。結果顯示，小鼠首次免疫后21 d，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302組的IgG 抗體水平高于其他免疫組；GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組與合成肽疫苗組在免后第42 d 抗體水平達到最高，第49 d開始小幅度下降，兩組抗體水平差異不顯著（p＞0.05）。GEM-B（T1BT2）4B 組免后抗體水平上升緩慢，與GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組相比，抗體水平差異顯著（p＜0.05）（圖1）。表明免疫增強劑CVC1032 能夠增強GEM-B（T1BT2）4B 誘導的小鼠免疫反應。

2.2 仔豬對疫苗的免疫應答反應 利用O 型FMD液相阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測仔豬血清液相阻斷抗體水平，根據OIE 制定的參考標準，血清抗體滴度＞1∶64 判為陽性，＜1∶40 判為陰性。結果顯示，首免后56 d，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組與合成肽組能夠產生高水平的液相阻斷抗體。GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組 的10 頭 豬 的 抗 體 水 平 均在1∶128 以上，GEM-B（T1BT2）4B 組的抗體水平為1∶73.5。GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組抗體水平顯著高于B（T1BT2）4B 組（p＜0.01），與合成肽免疫組抗體水平差異不顯著（p＞0.05）（圖2）。表明CVC1302能夠增強GEM-B（T1BT2）4B 的免疫原性，并且能夠顯著提高免疫豬的抗體水平。

圖1 FMDV VP1 結構蛋白抗體檢測結果Fig.1 Detection of antibodies against FMDV VP1 structural protein in mice using ELISA

圖2 豬血清液相阻斷抗體滴度Fig.2 Antibody titers in swine detected with LPB ELISA kit

2.3 淋巴細胞增殖試驗結果 采用MTT 法對小鼠脾臟淋巴細胞進行檢測。結果顯示，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組小鼠加強免疫后14 d 淋巴細胞增殖指數達到3.15±0.06，統計學分析結果顯示，與商品化的人工合成肽疫苗所引發(fā)的T 細胞增殖反應差異不明顯（p＞0.05），與GEM-B（T1BT2）4B 組差異極顯著（p＜0.01）（圖3）。表明免疫增強劑CVC1302能夠引起特異性的淋巴細胞增殖反應。

2.4 細胞因子檢測結果 分離免疫后35 d 的小鼠脾臟，提取RNA，參考文獻[13]的方法采用熒光定量PCR 方法檢測IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達水平。結果顯示，GEM-B（T1BT2）4B+CVC1302 組小鼠的IFN-γ 與IL-4 的表達水平顯著高于GEM-B（T1BT2）4B 組（p＜0.01），與合成肽疫苗組差異不顯著（p＞0.05）。所有實驗組IL-10、TNF-α水平變化均不顯著（p＞0.05）（圖4），表明CVC1302 免疫增強劑能夠誘導小鼠產生明顯的Th1 型免疫反應。

圖3 疫苗免疫小鼠淋巴細胞增殖檢測結果Fig.3 T-cell proliferation responses in the mice after BLP vaccine immunization

圖4 免疫小鼠相關細胞因子檢測結果Fig.4 Detection of cytokines for immunized mice at 35 days post primary vaccination

3 討 論

疫苗接種是預防和控制FMD 的可靠手段。FMD液相阻斷ELISA 抗體是公認的檢測指標，且液相阻斷ELISA 抗體水平與攻毒保護有一定的相關性，抗體滴度越高，保護率越高[14]。FMDV VP1 結構蛋白的aa141～aa160 和aa200～aa213 是FMDV 的 主 要 中 和表位，許多FMDV 表位疫苗的研究均含有這兩個主要的抗原表位，并且均有較好的免疫效果[15-16]。王長怡將O 型FMDV VP1 蛋白aa141～aa160 位肽段和一個具有廣譜性的輔助T 細胞表位進行化學合成，將其制備疫苗免疫豬后可以抵抗104.5TCID50FMDV 的強毒攻擊[17]，且已經形成商品化疫苗。但多肽的化學合成生產成本較高，本研究利用本實驗室前期構建的O 型FMD BLP 疫苗配合免疫增強劑CVC1302 進行動物免疫試驗，不僅能夠提高VP1 結構蛋白特異性抗體，而且能夠提高液相阻斷ELISA 抗體的水平；且方法操作簡便，生產成本低廉。

免疫增強劑CVC1302 含有多種TLR 受體的激動劑，能夠顯著提高機體的先天性免疫反應，提高并延長疫苗抗原的免疫效力[18]。研究表明，提高機體的細胞免疫水平對于預防FMDV 的感染具有重要的意義，高水平的細胞免疫反應對FMDV 感染初期降低FMD 發(fā)病率具有重要的意義[19-20]。添加免疫增強劑CVC1302 的BLP 疫苗能夠顯著提高IL-4、IFN-γ的表達水平，這可能將會對增強機體的抗病毒感染能力具有一定的作用。

傳統的FMD 滅活疫苗在FMD 的防控中發(fā)揮了重要的作用。2012 年國務院辦公廳發(fā)布實施的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》中將FMDV 的凈化納入了該規(guī)劃，迫切需要能夠代替?zhèn)鹘y滅活苗的安全有效的疫苗，而亞單位疫苗通常以重組純化蛋白或多肽為基礎，在生物安全方面明顯優(yōu)于傳統疫苗，但免疫原性稍有不足。綜上所述，免疫增強劑CVC1302和O型FMDVBLP 疫苗聯合使用能夠顯著增強機體的體液和細胞免疫反應，為我國FMD 的清除提供新的思路，為FMD 亞單位疫苗的發(fā)展提供新的借鑒。