腸出血性大腸桿菌O157 多重PCR 檢測方法的建立

張昕楊，李火明，夏 穎，李干武，蔡文通

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一種嚴重的食源性病原菌。依感染程度不同，被感染者會有腹瀉、出血性結腸炎或溶血性尿毒綜合癥等癥狀。EHEC 的多種血清型中，以O157 的危害最嚴重、最廣泛[1]。牛、羊等被認為是EHEC O157 的天然宿主，其養(yǎng)殖過程中的物料、排泄物、肉品等是污染食物的重要來源[2]。檢測EHEC O157 的常用方法有基于選擇性培養(yǎng)基的分離增菌和免疫學方法等。而分離增菌的方法消耗時間較長，特異性有待提高；免疫學方法雖能減少檢測時間，卻因為交叉反應而使其應用受限?；诙玖蚧蛱禺愋曰蛐蛄械亩嘀豍CR 法則耗時短、靈敏、準確，是檢測中常用的方法。

雙組份調控系統(tǒng)是廣泛存在于細菌的信號轉導系統(tǒng)，它通常介導細菌對環(huán)境、宿主的適應性[3]。雙組份調控系統(tǒng)的調控蛋白fusR[4]和n5512[5]分別編碼于OI-20 和OI-1136 基因島上，fusR 和n5512 與EHEC的O157 血清型高度相關：NCBI 數據庫中的EHEC O157 中都含有fusR 和n5512 基因，個別O55 血清型的菌株中也有，而O157 被認為是從O55 進化而來的；fusR 和n5512 基因的序列保守性很強，高達98.3%。在其它細菌中，沒有高度同源的基因。因此，fusR 和n5512 是潛在的優(yōu)良檢測靶標。本研究通過整合入兩個EHEC O157 的毒力調控蛋白編碼基因fusR 和n5512，加入經典的特征性基因rfbE（O157菌體抗原基因）與毒力基因stx1（志賀氏毒素I 型編碼基因）和stx2（志賀氏毒素II 型編碼基因）[6]，而后優(yōu)化反應條件，建立一種穩(wěn)定、可靠的檢測EHEC O157的多重PCR 方法，并對人工染菌的飼料、肉品等進行了檢測，為現地應用提供了可行技術。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物 假結核耶爾森菌（縮寫為pstb，cmccb 53501）和EHEC O157 BuyATCC（cgmcc 243708）購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心；EPEC（ATCC11775）購自美國模式培養(yǎng)物存儲庫（ATCC）；EHEC O157 HBWH、 EHEC O157 XUZ-1、 EHEC O157 HVRI、EHEC O157 NongB、ETEC-1、M22-5 為臨床分離株；EDL933 和Salmonella LT2 由本實驗室保存。BALB/c 小鼠購自維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 DNA Marker 和細菌基因組DNA 提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購自Invitrogen 公司；染料和2×Taq Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；50×TAE 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank 中登錄的EHEC EDL933 的stx1 基 因、stx2 基 因、rfbE 基 因、fusR 基因和n5512 基因，采用CloneManager 軟件設計5 對特異性引物（表1），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 PCR 引物信息Table 1 Information about the PCR primers

1.4 基因組DNA的制備 利用細菌基因組DNA 提取試劑盒分別提取本研究涉及的EDL933、BuyATCC、HBWH、HVRI、XUZ-1、NongB、ETEC-1、EPEC、M22-5、Salmonella LT2、pstb各細菌基因組DNA。

1.5 多重PCR 反應條件的優(yōu)化 以EHEC O157 EDL933 株基因組DNA 為模板， 采用方陣試驗（表2），對PCR引物濃度進行優(yōu)化；退火溫度設定為比引物的Tm值低5度。由此，確定最佳的PCR反應條件。

1.6 多重PCR 特異性試驗 利用優(yōu)化的PCR 反應體系對提取的各病原基因組DNA 進行擴增，以不添加模板為陰性對照，EDL933 模板為陽性對照，檢測多重PCR 體系的特異性。

表2 正交試驗優(yōu)化引物濃度Table 2 Optimization of primer concentrations using an orthogonal test

1.7 多重PCR 敏感性試驗

1.7.1 以細菌培養(yǎng)物為模板的多重PCR 敏感性試驗將對數生長期EDL933 和BuyATCC 菌液的初始濃度調至5×106cfu/mL，依次10倍稀釋至5×101cfu/mL。將稀釋好的菌液100 ℃水浴10 min，12 000 r/min 離心2 min，取2 μL 上清液做模板。按已優(yōu)化好的反應條件和反應體系進行多重PCR 擴增，PCR 產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測本實驗建立的多重PCR反應的敏感性。

1.7.2 以基因組DNA 為模板的多重PCR 敏感性試驗 將提取的EDL933 DNA 通過分光光度計測定濃度后，利用滅菌雙蒸水對模板分別進行10 倍梯度稀釋，由2.27×101ng/μL 稀釋至2.27×10-10ng/μL。以稀釋好的DNA 為模板，按已優(yōu)化的反應條件和反應體系進行多重PCR 擴增， PCR 產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測本實驗建立的多重PCR 反應的敏感性。

1.8 多重PCR的重復性試驗 利用本研究建立的多重PCR方法，每2周檢測一次EDL933 DNA模板，并連續(xù)檢測2 個月，以檢測該多重PCR 檢測方法的穩(wěn)定性。

1.9 多重PCR 方法對人工染菌樣品中EHEC O157的檢測

1.9.1 飼料、土壤、牛肉、廢水樣品集菌后與增菌后的多重PCR 檢測 集菌法：將菌懸液由108cfu/mL進行10 倍梯度稀釋后取各濃度菌液40 μL，分別人工接種于10 g 無菌飼料、10 g 無菌土壤、5 g 無菌牛肉、10 mL 無菌廢水中，加入30 mL 滅菌水，充分震蕩后靜置10 min，取上清1 000 r/min 離心5 min，取上清，5 000 r/min 離心5 min，棄去上清，200 μL 滅菌水重懸菌體沉淀，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心2 min，取2 μL 上清液做為模板，進行多重PCR 擴增。

增菌法：將菌懸液由103cfu/mL 進行10 倍梯度稀釋后各濃度菌液取40 μL 分別人工接種于10 g 無菌飼料、10 g 無菌土壤、5 g 無菌牛肉、或10 mL 無菌廢水中，處理步驟同上直到得到菌體沉淀，加入10 mL 液體LB 重懸沉淀，37 ℃培養(yǎng)8 h～12 h。取1 mL 增菌液12 000 r/min 離心2min，取2 μL 上清液做為模板，進行多重PCR 擴增。

1.9.2 糞便樣品集菌后與增菌后的多重PCR 檢測將EDL933 菌液于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，5000 r/min 離心5 min 收集菌體，滅菌水重懸沉淀，通過灌胃接種SPF BALB/c 小鼠，48 h 和72 h 后分別收集小鼠糞便。

集菌法與增菌法：將10 g 飼料改為1 g 小鼠糞便，其它處理方法同1.9.1。以1.9.1 方法制備模板并進行多重PCR 擴增。

1.9.3 樣品檢測限的計算 檢測限（cfu/g）=

2 結 果

2.1 多重PCR 反應優(yōu)化結果 以EHEC O157 的臨床分離株EDL933 的基因組DNA 為模板，對各引物濃度進行優(yōu)化，結果顯示，各個引物的添加量分別為stx1 上 下 游 引 物 各0.5 μL（0.25 μmol/L）、stx2 和n5512 上下游引物各1 μL（0.5 μmol/L）、rfbE 和fusR上下游引物各1.5 μL（0.75 μmol/L）；反應程序為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、52.3 ℃30 s、72 ℃1 min，共32 個循環(huán)；72 ℃5 min。

圖1 引物濃度的L9（53）正交試驗結果Fig.1 L9(53)orthogonal test on primer concentrations

2.2 多重PCR 特異性試驗結果 利用已優(yōu)化的多重PCR 反應體系對各菌株進行檢測，結果顯示，6 株為EHEC O157，HBWH 和NongB 只 有stx2 而 沒 有stx1，HVRI 和XUZ-1 只有stx1 而無stx2；EDL933 和BuyATCC帶有全部5 個基因；其它病原無擴增條帶（圖2）。表明本實驗建立的多重PCR 體系特異性較強。

圖2 多重PCR 特異性試驗結果Fig.2 Specificity of the multiplex PCR method using various bacterial strains as templates

2.3 多重PCR 敏感性試驗結果

2.3.1 以細菌培養(yǎng)物為模板的多重PCR 敏感性試驗結果 對梯度稀釋的EDL933 和BuyATCC 菌液進行多重PCR 檢測，結果顯示，在104cfu/mL（相當于PCR 反應有約200 cfu）時，仍能夠擴增出相應的目的條帶（圖3），表明本實驗建立的多重PCR 方法對細菌培養(yǎng)物的檢測敏感性較好。

圖3 菌液PCR 敏感性試驗結果Fig.3 Bacterial fluid PCR sensitivity of the multiplex PCR method using boiled bacteria

2.3.2 以基因組DNA 為模板的多重PCR 敏感性試驗結果 以梯度稀釋的EDL933 基因組DNA 為模板進行多重PCR 檢測，結果顯示，多重PCR 的檢測限約為2.27×10-2ng/μL（PCR 體系內模板約為1 pg）（圖4），表明本實驗建立的多重PCR 方法對DNA 的檢測敏感性較好。

圖4 基因組DNA 敏感性試驗結果Fig.4 Genomic DNA sensitivity test results

2.4 多重PCR 重復性試驗結果 利用已優(yōu)化的多重PCR 反應體系及反應條件進行了多次重復試驗，均能夠清晰的擴增出相應的目的片段，表明本實驗建立的多重PCR 方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 人工染菌樣品中EHEC O157 的檢測 人工染菌飼料樣品經集菌制備的模板，多重PCR 檢測限為4×103cfu/g，增菌培養(yǎng)后多重PCR 的檢測限為4×10-4cfu/g；人工染菌土壤樣品經集菌制備的模板，多重PCR 檢測限為4×103cfu/g，增菌培養(yǎng)后多重PCR 的檢測限為4×10-2cfu/g；人工染菌牛肉樣品經集菌制備的模板，多重PCR 檢測限為8×10-1cfu/g，增菌培養(yǎng)后多重PCR 的檢測限為8×10-3cfu/g；人工染菌廢水樣品經集菌制備的模板，多重PCR 檢測限為4×103cfu/mL，增菌培養(yǎng)后多重PCR 的檢測限為4×10-3cfu/mL；人為感染EHEC O157 小鼠的糞便，也能夠通過多重PCR 方法對細菌成功檢出，而增菌前、對照組和陰性對照均為陰性結果（圖5）。表明將樣品進行增菌處理后，利用該方法檢測其敏感性、特異性和穩(wěn)定性均良好，可應用于檢測已污染EHEC O157 的多種樣品。

3 討 論

多重PCR 是檢測病原菌的常用方法。在建立方法時，靶標的選擇至關重要。對于EHEC O157 來說，毒力因子的研究已經有很多，常用的靶標基因有rfbE（O157 菌體抗原基因）、fliC（H7 鞭毛抗原基因）、eaeA（緊密素基因）、ehx（pO157 溶血素基因）和stx2（Vero 毒素2 基因）等[6-7]。根據報道，志賀氏毒素stx1 和stx2 是最重要的毒力因子，與致病程度直接相關，EHEC O157 可能帶有兩者之一或都有。而三型分泌系統(tǒng)編碼的eae，則存在于其它的致病型中，如EPEC[8]。pO157 質粒編碼的溶血素基因ehx，也存在于其它血清型，如O111 和O8 中[9]。所以，eae 和ehx 并不是最理想的靶標。本研究所建立的多重PCR 方法，包含了經典的rfbE、stx1 和stx2 基因。此外，該方法還包括了最近報道的應答調控因子編碼基因fusR 和n5512，這兩個基因除了與O157高度相關之外，還負責調控細菌毒力，是EHEC O157 在腸道定殖的關鍵基因[4-5]。由于fusR 和n5512在O157 的祖先O55 血清型中也有偶爾檢出[10]，所以單獨檢測fusR 和/或n5512 都有可能造成誤判；而且細菌間的基因水平轉移使得檢測單個基因具有較大誤判風險。因此，這5 個基因的組合不僅能有效的鑒定O157 血清型，還有助于了解毒力。

圖5 人工染菌飼料（A）、土壤（B）、牛肉（C）、廢水（D）及感染EHEC O157 小鼠糞便（E）的多重PCR 檢測Fig.5 Multiplex PCR detection of EHEC O157 in artificially contaminated animal feed(A),soil(B),beef(C),waste water(D),and feces from infected mice(E)

經實驗驗證發(fā)現，該PCR 體系對EHEC O157 的檢測具有很強的特異性：首先，可以區(qū)分含有stx1和/或stx2 的非O157 大腸桿菌；其次，其它常見的食源性病原菌也可以區(qū)分，如沙門氏菌和耶爾森菌。敏感性檢測實驗結果，與報道的其它方法對比如下：DNA 的檢測敏感度顯著高于楊小鵑等[11]（7.5 ng）和徐曉可等[12]（91 ng）的報道；檢測CFU 的敏感性略低于紀雪等[13]（35 個循環(huán)，5×103cfu）報道，可能是由于該PCR 體系的循環(huán)數低；但卻可降低由于氣溶膠等導致的非特異性擴增。此外，為了驗證該方法在現地的實用性，本研究還對人工染菌的肉品、飼料、土壤、養(yǎng)殖廢水以及腸道定殖EDL933 小鼠的糞便等進行了檢測。經增菌后，檢測限很低，低于10 個cfu/g，比Nagaraja 研究組報道的類似方法的檢測限低約一個數量級[14-15]。但是Nagaraja 研究組利用fliC、stx1、stx2、eae、rfbE 和hlyA 6 個基因用于檢測O157∶H7，而且PCR 的反應程序有所不同，只有25個循環(huán)。攝入EHEC O157 后被感染的下限約為10 cfu～102cfu，所以該方法完全滿足檢測要求。綜上，本研究建立的檢測方法為食源性腸出血性大腸桿菌O157 的防控提供了可靠的工具。