秦皇島地區(qū)狐源大腸桿菌致病性及耐藥性研究

劉勃興，史秋梅，趙安奇，杜萬(wàn)年，柳翠翠，劉 暢，李 浩，張志強(qiáng)

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004）

大腸桿菌是一種條件性致病菌，廣泛存在于自然界中，主要通過(guò)飲水、食物傳播，并可以感染多種動(dòng)物發(fā)病[1]。在毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖中，大腸桿菌病十分普遍，且常與其它病原微生物造成混合感染或繼發(fā)感染。大腸桿菌感染狐，主要導(dǎo)致仔狐敗血癥、腹瀉、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)損傷，并可致母狐流產(chǎn)、死胎[2]。狐等毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖是秦皇島地區(qū)的重要產(chǎn)業(yè)，大腸桿菌所致疾病對(duì)該地區(qū)的毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

臨床上，對(duì)大腸桿菌病的治療以抗生素類(lèi)藥物為主。但隨著抗生素類(lèi)藥物的不合理應(yīng)用，大腸桿菌對(duì)抗生素藥物的耐藥性日益嚴(yán)重，在臨床上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)抗生素?zé)o法有效的控制住大腸桿菌病，導(dǎo)致動(dòng)物病情惡化甚至死亡，最終造成經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)上述現(xiàn)狀，本研究對(duì)2019 年從秦皇島地區(qū)分離的51株狐源大腸桿菌的致病性及耐藥性進(jìn)行研究，為該地區(qū)狐大腸桿菌病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源 從秦皇島市昌黎縣、盧龍縣、撫寧縣和青龍縣規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶(hù)以及養(yǎng)殖合作社采集病死狐肝臟、脾臟、肺臟、心臟等實(shí)質(zhì)器官病料樣品。

1.2 主要試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋科技股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物科技股份有限公司；2×Taq Master Mix、細(xì)菌DNA 基因組提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL2000 plus DNA Marker 購(gòu)自中科瑞泰科技有限公司；質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922、潔凈級(jí)昆明小鼠（20±2 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；PCR 擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 無(wú)菌采取病死狐病料樣品，從肝臟、脾臟、肺臟、心臟等實(shí)質(zhì)臟器分離細(xì)菌，采用伊紅美藍(lán)和麥康凱培養(yǎng)基對(duì)分離菌初步鑒定，選取符合大腸桿菌菌落特征的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定和16S rDNA 序列分析，最終分離出51 株狐源大腸桿菌。

1.4 分離菌的致病性試驗(yàn) 1 株分離菌為1 個(gè)感染組，每組5 只小鼠，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.1 mL 對(duì)數(shù)期菌液（濃度為1×107cfu/mL），對(duì)照組注射0.1 mL無(wú)菌PBS。觀察并記錄小鼠死亡情況。

1.5 分離菌的毒力基因檢測(cè) 參照細(xì)菌DNA 基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，并以其為模板，參考文獻(xiàn)[3]中的毒力基因引物序列合成引物，PCR檢測(cè)分離菌iss、intimin、ler、irp2、fyuA、vat、hlyF、astA、iucD、papC、eaea、iroN、ompT、fimC 毒力基因攜帶情況。

1.6 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）藥物敏感性試驗(yàn)操作方法，采用KB 紙片法檢測(cè)51 株分離菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林等15 種抗生素類(lèi)藥物的敏感性。按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。大腸桿菌ATCC25922 為藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌。

1.7 分離菌的耐藥基因檢測(cè) 以提取的分離菌的DNA 為模板，參考文獻(xiàn)[3]中的耐藥基因引物序列合成引物，PCR 檢測(cè)分離菌的tetA、tetC、sul1、sul3、qnrA、qnrB、gyrA、gyrB、CTX-M、SHV、addA1、strA、strB、ermA、mefA 耐藥基因。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的致病性試驗(yàn)結(jié)果 分離菌感染小鼠后連續(xù)觀察1 周。結(jié)果顯示，感染組小鼠精神沉郁，站立不穩(wěn)，呼吸頻率紊亂，對(duì)外界刺激反應(yīng)降低。51 組感染組小鼠均有死亡，死亡率在20%～100%。剖檢死亡小鼠，有明顯敗血癥癥狀，肝臟、肺臟出血最為嚴(yán)重。對(duì)死亡小鼠的肝臟、肺臟、心臟等器官進(jìn)行細(xì)菌分離并鑒定，同樣分離到大腸桿菌，經(jīng)生化鑒定與16S rDNA 序列分析，從病死小鼠分離出的大腸桿菌與感染菌株指標(biāo)相近。表明51 株分離菌均具有一定的致病力。

2.2 分離菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果 采用PCR方法對(duì)分離菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢測(cè)的14種毒力基因中共檢出10 種毒力基因：intimin、iucD、ler、irp2、eaea、fyuA、iroN、ompT、hlyF、fimC，檢出率在1.96%～96.08%，其中fimC 基因檢出率最高，為96.08%（49/51）。未檢出iss、astA、papC、vat 毒力基因（表1）。對(duì)每株分離菌檢出毒力基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢出1 種毒力基因菌株最多，占比35.29%（18/51）（圖1）。結(jié)果表明，不同分離菌株攜帶毒力基因種類(lèi)復(fù)雜。

表1 分離菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of virulence genes of isolated bacteria

圖1 分離菌毒力基因檢出數(shù)量與菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 Statistical results of the number of virulence genes detected and the number of strains isolated

2.3 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 采用KB 紙片檢測(cè)分離菌對(duì)抗生素藥物的敏感性，按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果顯示，51 株分離菌對(duì)氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AML）、新霉素（NEO）、環(huán)丙沙星（CIP）、氟苯尼考（FFC）、替米考星（TMS）、土霉素（OTC）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲氧嘧啶（SM2）、復(fù)方新諾明（SXT）高度耐藥，耐藥菌株占72.55%～94.12%。分離菌對(duì)阿米卡星（AK）、恩諾沙星（ENR）較敏感，敏感菌株分別為66.67%（34/51）、80.39%（41/51）（圖2）。對(duì)分離菌的多重耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分離菌中對(duì)12 種、13 種、14 種抗生素耐藥的菌株較多，占比分別為23.53%（12/51）、21.57%（11/51）、21.57%（11/51）。分離菌最少對(duì)8 種抗生素耐藥，菌株占比3.92%（2/51），最多對(duì)15 種抗生素耐藥，菌株占比1.96%（1/51）（圖3）。分離菌株耐藥情況很?chē)?yán)重，且均表現(xiàn)為多重耐藥，臨床用藥應(yīng)結(jié)合分離的大腸桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，注意合理應(yīng)用各抗生素。

圖2 分離菌對(duì)15 種抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The sensitivity test rate of isolated bacteria to 15 kinds of antibiotics

圖3 分離菌多重耐藥情況Fig.3 Multidrug resistance of the isolated bacteria

2.4 分離菌的耐藥基因檢測(cè) 采用PCR 方法對(duì)分離菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，tetA、tetC、sul1、mefA 基因未檢出，gyrA、gyrB、addA1 基因檢出率高達(dá)100%，sul3、qnrA、qnrB、CTX-M、SHV、strA、strB、ermA 基因檢出率分別為37.25%（19/51）、13.73%（7/51）、19.61%（10/51）、35.29%（18/51）、19.61%（10/51）、52.94%（27/51）、62.75%（32/51）、11.76%（6/51）（表2）。對(duì)每株分離菌的耐藥基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，51 株分離菌分別檢測(cè)到3～9 個(gè)耐藥基因，其中檢出6 個(gè)耐藥基因的菌株數(shù)最多，占比33.33%（17/51）。分離菌株均攜帶有3 種及以上耐藥基因，且不同菌株耐藥基因攜帶情況不同（圖4）。51 株分離菌均攜帶有多種耐藥基因，不同菌株耐藥基因攜帶情況有一定的差別，并且耐藥基因檢出率與抗生素耐藥性數(shù)值不完全符合。

表2 分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of drug resistance genes in isolated bacteria

圖4 分離菌耐藥基因個(gè)數(shù)與菌株數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 Statistical results of the number of drug-resistant genes and strains in isolated bacteria

3 討 論

2019 年，本研究室采集秦皇島地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶(hù)、養(yǎng)殖合作社等病死狐肝臟、肺臟、心臟等實(shí)質(zhì)器官樣品，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌的分離，經(jīng)鑒定，分離出51 株大腸桿菌。為確定分離菌的致病性，本研究以小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，51 株分離菌均對(duì)小鼠具有致病性，表明本次研究的51 株狐源大腸桿菌均具有一定的致病能力，同時(shí)提示在臨床診治狐相關(guān)疾病時(shí)，大腸桿菌是不容忽視的重要病原。

對(duì)分離菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出10 種毒力基因，分別為intimin、iucD、ler、irp2、eaea、fyuA、iroN、ompT、hlyF、fimC。檢出率最高的毒力基因?yàn)閒imC，檢出率為96.08%。fimC 為黏附素I 型菌毛毒力基因，其編碼FimC 蛋白介導(dǎo)I 型菌毛的裝配，該基因變異可導(dǎo)致菌毛無(wú)法正常合成[4]。有研究表明，在雞源高致病大腸桿菌菌株中，fimC 基因檢出率較高[5-6]。劉雪威用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了fimC基因缺失雞致病性大腸桿菌，并驗(yàn)證了該基因缺失可使大腸桿菌對(duì)雞的毒力下降[7]。據(jù)李巧玲報(bào)道，秦皇島地區(qū)狐肺炎大腸桿菌fimC 基因檢出率71.4%（55/77）[3]，而本研究狐源大腸桿菌fimC 基因檢出率明顯高于李巧玲的報(bào)道，這可能是由于采樣時(shí)間和樣品來(lái)源不同所造成。在狐源大腸桿菌fimC 基因檢出率較高，表明該基因可能與狐源大腸桿菌的致病性有關(guān)，但目前雞源大腸桿菌fimC 基因研究較多，而在狐源大腸桿菌該基因的相關(guān)研究未有報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。對(duì)每株分離菌的毒力基因檢出數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)分離菌分別檢出0～7 種毒力基因，不同菌株的之間毒力基因攜帶情況不同，表明分離菌株毒力基因攜帶情況十分復(fù)雜。有1 株分離菌在本研究中未檢測(cè)到毒力基因，但在致病性試驗(yàn)中該菌株同樣對(duì)小鼠具有致病性，表明該菌可能攜帶本研究中檢測(cè)14 種毒力基因之外的其它毒力基因，需要我們進(jìn)一步研究。

目前，大腸桿菌的耐藥性日益嚴(yán)重，給臨床治療帶了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此致病性大腸桿菌耐藥性的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究對(duì)分離51 株狐源大腸桿菌耐藥性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離菌株具有嚴(yán)重的多重耐藥性。分離菌株中最少對(duì)8 種，最多對(duì)15 種抗生素耐藥，其中分離菌中對(duì)12 種抗生素耐藥的菌株數(shù)最多。分離菌對(duì)15 種抗生素中氨芐西林、阿莫西林、新霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、替米考星、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明表現(xiàn)高度耐藥，對(duì)阿米卡星、恩諾沙星敏感性較高。有相關(guān)報(bào)道[3，8-10]，狐源致病大腸桿菌多重耐藥普遍存在，在秦皇島地區(qū)狐源大腸桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥性普遍較高，因此不推薦該地區(qū)繼續(xù)應(yīng)用磺胺類(lèi)藥物治療狐大腸桿菌病，而其他類(lèi)抗生素藥物耐藥率各不相同，建議臨床用藥前可先通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)抗生素藥物的抗菌效果，合理聯(lián)合用藥進(jìn)行治療。

為了進(jìn)一步了解分離菌的耐藥性，本研究對(duì)分離菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，51 分離菌分別檢測(cè)出3～9 耐藥基因，其中g(shù)yrA、gyrB、addA13種耐藥基因檢出率高達(dá)100%。gyrA、gyrB 為喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥基因。喹諾酮類(lèi)藥物作用于細(xì)菌的DNA 回旋酶，影響該酶的活性，使細(xì)菌DNA 無(wú)法正常螺旋從而起到抗菌效果。gyrA、gyrB 基因分別編碼DNA 回旋酶的2 個(gè)A 亞基和2 個(gè)B 亞基，這2 個(gè)基因突變使喹諾酮類(lèi)藥物與細(xì)菌結(jié)合率下降，造成細(xì)菌耐藥[11-12]。addA1 為氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥基因。氨基糖苷類(lèi)藥物作用于細(xì)菌核糖體30S 亞基，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成達(dá)到抗菌效果[13]。addA1 是氨基糖苷類(lèi)轉(zhuǎn)移酶的重要基因，氨基糖苷類(lèi)轉(zhuǎn)移酶是氨基糖苷類(lèi)抗生素鈍化酶，可對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素進(jìn)行修飾導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[14-15]。2019 年上半年，狐源大腸桿菌的gyrA、gyrB、addA1 耐藥基因流行率較高，表明在該地區(qū)狐源大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)耐藥水平較高，應(yīng)引起重視。而其它耐藥基因有不同程度的檢出，且不同菌株耐藥基因攜帶情況十分復(fù)雜，提示在臨床治療該病的時(shí)候應(yīng)按照規(guī)定合理用藥，避免濫用現(xiàn)象，減少耐藥基因的產(chǎn)生與傳播，同時(shí)對(duì)大腸桿菌耐藥機(jī)制產(chǎn)生原因做進(jìn)一步研究，從根源上解決大腸桿菌耐藥問(wèn)題。將分離菌的耐藥基因檢出情況與藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩者數(shù)值不能完全符合，分析該現(xiàn)象產(chǎn)生原因，可能與耐藥性相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)的存在一定的誤差，并且細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生是由多個(gè)基因，多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。但通過(guò)細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)，可以了解細(xì)菌的耐藥情況并作出預(yù)防措施，具有公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本研究對(duì)2019 年從秦皇島地區(qū)分離的51 株狐源大腸桿菌的致病性及耐藥性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離菌均具有一定的致病性，且對(duì)抗生素類(lèi)藥物表現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥性，為狐源大腸桿菌病的致病菌和指導(dǎo)臨床用藥提供參考。