閩西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒FJLY1703 株基因特征及遺傳進(jìn)化分析

董 波，傅云扉，戴愛玲，李曉華，楊小燕*

（1. 龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2. 福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 364012）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，屬于冠狀病毒科的α冠狀病毒（Alphacoronavirus）屬，易感染哺乳期仔豬。臨床癥狀主要有吸收不良、腹瀉、脫水、嘔吐和消瘦等[1]。當(dāng)前，PEDV已在全球范圍內(nèi)廣泛流行，特別在歐洲、亞洲和美國等國家和地區(qū)。2013年，PED疫情席卷整個美國，給其養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了全球關(guān)注[2]。PEDV于1984年在我國首次發(fā)現(xiàn)，由于其高致病性和高致死率，為中國養(yǎng)豬業(yè)帶來了持續(xù)挑戰(zhàn)[3]。2010 年10 月，我國多個省份爆發(fā)PED 疫病，大量哺乳仔豬均出現(xiàn)了水樣腹瀉，脫水和嘔吐等典型癥狀[4-6]。隨后，此次疫情迅速蔓延到世界各國，日本、加拿大、墨西哥和哥倫比亞也都經(jīng)歷了持續(xù)的PED 疫情暴發(fā)[7-8]。據(jù)報道，此次PED 的流行與其病原PEDV 的毒力變化有關(guān)，即新型PEDV病毒株的出現(xiàn)，威脅著世界養(yǎng)豬業(yè)[7]。

PEDV 編碼2 個復(fù)制酶多聚蛋白ppla 和pplab，1個非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3 和4 個結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核殼蛋白（N）和小膜蛋白（E）[9]。自20 世紀(jì)90 年代以來，我國養(yǎng)豬場已實施定期接種疫苗策略，以控制PED 的流行。然而，采用了PED CV777疫苗株免疫仍然未能阻擋2010 年P(guān)ED 的大流行，說明當(dāng)前流行株的毒力增強，傳統(tǒng)疫苗未能提供有效保護(hù)。在對PEDV 的遺傳進(jìn)化分析中，僅研究其單個結(jié)構(gòu)基因，無法完全確定病毒株的遺傳進(jìn)化特征?；诖耍狙芯繌母＝ㄊ↓垘r市某規(guī)?；B(yǎng)豬場的一例確診為PEDV 感染仔豬小腸樣品中經(jīng)PCR擴(kuò)增了PEDV 的E、M、N 和S 基因，并對其序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，同時，對其S 基因進(jìn)行了重組和相似性分析。為了解閩西地區(qū)PEDV 流行株的基因特征和遺傳進(jìn)化規(guī)律提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2017 年12 月福建省龍巖市某規(guī)模化養(yǎng)豬場送檢1 例疑似PEDV 感染仔豬，臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、脫水等癥狀。剖檢后，取出其小腸及腸內(nèi)容物，樣品經(jīng)常規(guī)處理提取總RNA 后，經(jīng)RT-PCR 檢測確診其為PEDV 感染。將鑒定的該病毒命名為閩西FJLY1703 株。

1.2 主要試劑 AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、Axy?Prep凝膠回收試劑盒，購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；RNAiso Plus、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、5×M-MLV Buffer、pMD18-T 載體，購自寶生物工程（大連）有限公司；DL2000 DNA Marker、10×Loading Buf?fer，購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計 參考GenBank已登錄的PEDV病毒株（AF353511.1）cDNA 序列，設(shè)計了7 對引物（表1）用于擴(kuò)增其E、M、N 和S 基因。引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海）合成。

表1 擴(kuò)增E、M、N 和S 基因的引物Table 1 Amplification primers for the E,M,N and S genes

1.4 樣品中病毒基因的的PCR擴(kuò)增與其序列分析 從1.1 處理的樣品中提取病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用1.2中的特異性引物PCR擴(kuò)增4個結(jié)構(gòu)基因，其中S基因采用了4段PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后分別連接至pMD19-T 載體；構(gòu)建的重組質(zhì)粒均經(jīng)PCR 鑒定。鑒定陽性的重組質(zhì)粒由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海）測序鑒定。

1.5 PEDV 結(jié)構(gòu)基因的同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank下載PEDV的參考株基因序列，將PCR擴(kuò)增并經(jīng)測序正確的FJLY1703 株的4 段S 基因片段經(jīng)拼接完整后與E、M 和N 基因序列分別利用DNAMAN 軟件與PEDV 參考株相應(yīng)基因序列進(jìn)行同源性分析，并采用MEGA 5.2 軟件分別構(gòu)建這幾個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

1.6 PEDV S 基因的重組分析 分析FJLY1703 株與本研究中下載的其它PEDV 病毒株S 基因核苷酸序列的相似性和重組事件。利用遺傳算法重組檢測（GARD）對重組位點進(jìn)行篩選[11]。使用SimPlot 3.5 對潛在重組事件進(jìn)行相似性映射和自助掃描分析[12]。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)構(gòu)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用特異性引物，以1.4 中 獲 得 的PEDV cDNA 為 模 板，PCR 擴(kuò) 增 其E、M、N 和S 基因的4 個片段。結(jié)果顯示，獲得231 bp、681 bp、1 326 bp、1 031 bp、1 146 bp、1 154 bp 和1 355 bp的目的條帶，均與預(yù)期相符（圖1）。測序結(jié)果顯示，所獲得的基因序列均為PEDV 相應(yīng)目的基因大小一致（圖1）。表明，獲得PEDV FJLY1703 株4 個結(jié)構(gòu)基因目的片段。

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 PEDV 結(jié)構(gòu)基因的同源性分析 將測序獲得的FJLY1703 株的N、E、M 和S 基因分別與GenBank 中登錄的疫苗株CV777 等參考株的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比較，分析其同源性。結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株N基因核苷酸序列與2010 年后國內(nèi)PEDV 流行株相應(yīng)基因序列同源性較高（94.8%～97.8%），然而，其與早期國內(nèi)外分離株以及疫苗株CV777 相應(yīng)基因序列的同源性較低（93.7%～94.8%）；E 基因序列同源性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株與2010 年后分離的PEDV 中國株呈現(xiàn)出高度的同源性（95.7%～99.6%），與早期疫苗株CV777 的同源性僅為95.2%；M 基因同源性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株M 基因序列與2010 年后國內(nèi)PEDV 流行株相應(yīng)基因序列同源性為97.1%～99.5%，與疫苗株CV777 等2010 年之前國內(nèi)流行株相應(yīng)基因序列同源性較低（96.7%～97.9%）；S 基因核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株與2010 年之前國內(nèi)病毒株同源性較低（93.5%～95.0%），與CV777 疫苗株的同源性僅93.9，但與2010 年后國內(nèi)流行株的同源性為96.0%～97.3%。結(jié)果表明，F(xiàn)JLY1703 株主要結(jié)構(gòu)基因均與當(dāng)前國內(nèi)流行株同源性較高，而與CV777 疫苗株同源性較低。

2.3 PEDV 結(jié)構(gòu)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 N 基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株屬于G2 群G2b 亞群，該群包括多數(shù)國內(nèi)流行株和一株早期韓國株virulent DR13，而CV777 疫苗株屬于G1 群。E、M、S 基因的遺傳進(jìn)化分析均顯示，F(xiàn)JLY1703 株屬于G2群的G2b 亞群，該亞群還包括大多數(shù)國內(nèi)流行變異株，而CV777 疫苗株屬于G1 群的G1a 亞群。S 基因遺傳進(jìn)化分析見圖2。綜上結(jié)果表明，F(xiàn)JLY1703 株與當(dāng)前國內(nèi)外流行株具有極近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，而與CV777 等早期經(jīng)典疫苗株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 PEDV S 基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on S genes of PEDV

2.4 PEDV 結(jié)構(gòu)基因編碼的氨基酸序列分析 氨基酸序列分析結(jié)果顯示，N 基因全長1 326 bp，編碼226 個氨基酸，包括一個完整的開放閱讀框（ORF）。FJLY1703 株與疫苗株CV777 比較，其N 基因編碼的氨基酸序列中存在12 個突變位點（G84A、K122N、 A142T、 N204K、 R241K、 H242L、 K252R、 N255S、L380P、L395Q、Q397L、E400A），這些突變位點與2010年后分離的中國株比較無差異；M 基因編碼氨基酸序列與CV777 株比對結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株存在3個突變位點（E12Q、A42V、A213S），這些突變位點與中國流行株突變位點相似；E 基因編碼的氨基酸序列與CV777 株對比結(jié)果顯示，F(xiàn)JLY1703 株僅存在一處突變（R65Q），這一突變位點與其它2010 年后中國分離變異株的突變位點相似。FJLY1703 株與CV777株在N、E 和M 基因編碼氨基酸均存在差異，且這些差異均與國內(nèi)流行株相同。結(jié)果表明，該病毒是一株閩西地區(qū)的流行變異株。

PEDV S 基因在病毒侵染細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，并且S 基因也是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基因，含有4 個可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)域：COE、SS2、SS6 和2C10[13]。FJLY1703 株與經(jīng)典株CV777 比較，其S 基因編碼的氨基酸序列中COE 存在8 個突變位點（I521H、S523G、V527I、T550S、G594S、A605E、L612F、I635V）；其SS6 中存在1 個突變位點（Y766S），均與當(dāng)前國內(nèi)流行株突變位點相同。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，F(xiàn)JLY1703為一株流行變異株。

2.5 FJLY1703 株S 基因的重組分析結(jié)果 利用GARD 對FJLY1703 株S 基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育不一致和重組事件的比對分析與初步篩選。結(jié)果顯示，其突變點主要位于S基因5'端1 000 bp～1 500 bp 之間（圖3）。通過SimPlotv.3.5.1 評 價S 基 因 核 苷 酸 序 列 的 相 似 性，結(jié)果顯示FJLY1703 株在S 基因核苷酸序列5'端1 bp～1 200 bp 區(qū)域與G1 群病毒株相似性較低，而與G2b亞群以及G2a 亞群病毒株相似性較高，推測這一區(qū)域可能來自于G2 群病毒株，即來自PEDV 流行變異株。同時，F(xiàn)JLY1703 株S 基因1 200 bp～4 101 bp 區(qū)域與G1 群病毒株相似性高，推測這一區(qū)域可能來自于G1 群病毒株，即PEDV 早期經(jīng)典株（圖4）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)JLY1703 株為一株經(jīng)典株與變異株重組的閩西地區(qū)流行變異株。

圖3 S 基因重組位點的GARD 分析Fig.3 GARD analysis of S gene recombination sites

圖4 S 基因重組事件分析Fig.4 Recombination analysis of S gene

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，閩西株FJLY1703 的N、E 和M 基因遺傳進(jìn)化關(guān)系與2010 年后大部分中國分離株更為接近，屬于當(dāng)前國內(nèi)流行變異株。同時，對N基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，早期韓國疫苗株virulent DR13 與FJLY1703 株同屬于G2b 亞群，前者是由Vero細(xì)胞培養(yǎng)的弱毒株，早期被用于制備疫苗，而FJLY1703 株N 基因與virulent DR13 株遺傳進(jìn)化關(guān)系相近，表明FJLY1703 株N 基因可能來自于早期韓國株，這一結(jié)果與2010 年以后中國分離株可能起源于早期韓國株的報道相符[13-14]。

與其它冠狀病毒相同，PEDV S 基因在病毒侵入和病毒變異中起重要作用，被認(rèn)為是研究PEDV 遺傳特征最有價值的基因[15]。S 基因遺傳進(jìn)化分析顯示，F(xiàn)JLY1703 株與其它PEDV 流行變異株均處于G2群，表明這些病毒株同源性較高。該基因序列分析顯示，F(xiàn)JLY1703 株S 基因5'區(qū)域內(nèi)存在部分突變，這些變化與其它流行變異株相似。而與CV777 等早期經(jīng)典株差異較大。N、E、M、S 基因的遺傳進(jìn)化分析均顯示，F(xiàn)JLY1703 株與早期疫苗株（CV777）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示以早期經(jīng)典株CV777 為免疫原所制備的疫苗可能對當(dāng)前豬群的保護(hù)效果不理想，需要選擇當(dāng)前流行株為免疫原研制更為有效的疫苗。

有報道稱，PEDV 的重組事件主要發(fā)生在經(jīng)典株和變異株的S 基因，即當(dāng)前國內(nèi)流行株基本源于用作疫苗抗原的減毒疫苗株（CV777 或DR13）和高致病性的變異流行株的重組[16-17]。本研究將FJLY1703株S 基因和其它PEDV 病毒株S 基因進(jìn)行了重組分析。GARD 分析顯示，F(xiàn)JLY1703 株S 基因的5'端區(qū)域存在突變位點。核酸相似性分析顯示，F(xiàn)JLY1703株S 基因5'端1 bp～1 200 bp 區(qū)域與2010 年后國 內(nèi)流行株具有較高的序列相似性，而1 200 bp 以后區(qū)域則與CV777 等早期PEDV 經(jīng)典株相似性高，表明FJLY1703 株S 基因存在基因重組事件，進(jìn)一步證明FJLY1703 株為一株P(guān)EDV 流行株，來自于早期經(jīng)典株和流行變異株的重組。

氨基酸序列分析顯示，F(xiàn)JLY1703株N基因編碼的氨基酸序列中存在12個突變位點，其M基因和E基因編碼的氨基酸序列中分別存在3處和1處突變，這些突變位點均與2010年后國內(nèi)流行變異株相似。與CV777株相比，F(xiàn)JLY1703 株S 蛋白的中和表位COE 內(nèi)存在8個氨基酸突變位點，這些抗原區(qū)域的變化，可能會致使其具有更強的致病性。上述結(jié)果均表明FJLY1703株為當(dāng)前閩西地區(qū)流行變異株。本研究為了解閩西地區(qū)PEDV 地方流行株的基因特征和遺傳進(jìn)化規(guī)律提供了基礎(chǔ)研究資料。