口蹄疫病毒IRES RNA 元件與宿主蛋白eEF1a相互作用抑制病毒復(fù)制的研究

趙 博，楊德成，劉文明，曹志遠(yuǎn)，孫 超，于 力

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由FMD病毒（FMDV）引起的主要感染牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病的發(fā)生與流行不但嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)，也嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易。鑒于口蹄疫對(duì)世界經(jīng)濟(jì)造成的嚴(yán)重危害，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。

FMDV 屬于微RNA 病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的成員，基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約8.5 kb。FMDV基因組按功能可分為5'非翻譯區(qū)（5'UTR）、開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）、3'非翻譯區(qū)（3'UTR）和Poly（A）尾。5'UTR 長(zhǎng)約1 300 nt，主要包括S 片段、Poly（C）區(qū)段、假結(jié)節(jié)（PKs）區(qū)、以及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribo?some entry site，IRES）。IRES 長(zhǎng)約450 nt，形成多個(gè)莖環(huán)[2]，通過(guò)與多種真核翻譯起始因子和IRES 反式作用因子（ITAF）結(jié)合招募40S 和60S 核糖體亞基，介導(dǎo)病毒蛋白的翻譯。近年來(lái)，研究者在微RNA 病毒科中發(fā)現(xiàn)多種與病毒IRES 相互作用的宿主蛋白，并且表明這些宿主蛋白通過(guò)不同方式（影響IRES 的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性、影響IRES 對(duì)其他蛋白的招募、影響IRES 活性）調(diào)控病毒的感染及復(fù)制[3]。有報(bào)道顯示：Gemin5 蛋白通過(guò)C 端與FMDV IRES 結(jié)合，對(duì)PTB 結(jié)合產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，對(duì)IRES 介導(dǎo)的翻譯起始起負(fù)調(diào)節(jié)作用[4]；erbB-3 結(jié)合蛋白1（erbB-3-binding protein 1，Ebp1）與FMDV IRES 結(jié)構(gòu)域3 結(jié)合，與PTB 協(xié)調(diào)促進(jìn)FMDV IRES 的活性[5-6]；IRES 結(jié)構(gòu)域的替換可通過(guò)影響病毒蛋白的翻譯起始效率改變病毒的毒力和嗜性[7]。一般認(rèn)為，病毒IRES 元件與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用影響病毒的復(fù)制及感染能力，從而決定病毒的毒力及嗜性。然而，哪些宿主蛋白參與FMDV IRES 介導(dǎo)的翻譯以及其在病毒復(fù)制周期中的調(diào)控作用，知之甚少。

本研究以生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 為“誘餌”，通過(guò)RNA pulldown 試驗(yàn)聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選到了與IRES 可能存在特異性結(jié)合的宿主蛋白eEF1a，進(jìn)而采用western blot 和激光共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)了eEF1a-IRES 相互作用，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)eEF1a蛋白結(jié)合病毒感染研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抑制FMDV病毒復(fù)制的功能。這些結(jié)果將為深入研究eEF1a 蛋白在調(diào)控IRES 介導(dǎo)的翻譯起始及其在FMDV 感染和復(fù)制中發(fā)揮的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、病毒和質(zhì)粒 牛腎原代細(xì)胞pBK、豬腎細(xì)胞IBRS-2 和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；O 型FMDV O/YS/CHA/05 株由FMDV 全長(zhǎng)cD?NA 感染性克隆質(zhì)粒pYS[8]轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救所得；px458質(zhì)粒由美國(guó)麻省理工大學(xué)張峰教授惠贈(zèng)；pVAXIRES 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。pcDNA-HA 真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室基于pcDNA3.1（+）改造構(gòu)建。

1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Prim?erscript II 反轉(zhuǎn)錄酶、Prime STAR?HS DNA 聚合酶和各種限制性核酸內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB 公司；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico 公司；DynabeadsTMM-280 Streptavidin磁珠購(gòu)自Invitrogen 公司；Biotin-16-UTP、蛋白酶抑制劑cocktail 和X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Roche 公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7 kit 購(gòu) 自Promega 公 司；TRIzol 試 劑 購(gòu) 自Invitrogen 公司；無(wú)縫克隆連接酶購(gòu)自Vazyme 公司；ECL 發(fā)光液購(gòu)自Millipore 公司；抗O 型FMDV 的單克隆抗體（MAb）4B2 由本實(shí)驗(yàn)室制備；鼠源抗β-actin MAb 和鼠源抗HA MAb 均購(gòu)自Genescript 公司；鼠源抗雙鏈RNA（dsRNA）MAb J2 購(gòu)自SCICONS 公司；兔源抗eEF1a 抗體購(gòu)自Proteintech 公司；馬抗鼠IgG-HRP 和山羊抗兔IgG-HRP 均購(gòu)自Cell signaling 公司；山羊抗鼠TRITC 標(biāo)記IgG（IgG-TRITC）和山羊抗兔FITC 標(biāo)記IgG（IgG-FITC）均購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 生物素標(biāo)記IRES RNA pulldown 試驗(yàn) 將含有T7-FMDV IRES 的質(zhì)粒pVAX-IRES 經(jīng)EcoR V 酶切線性化后作為體外轉(zhuǎn)錄模板，采用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production systems-T7 在體外合成非生物標(biāo)記的FMDV IRES RNA。同時(shí)，按照上述方法在體外轉(zhuǎn)錄體系中添加4 μL 10 mmol/L Biotin-16-UTP 以合成生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA。體外轉(zhuǎn)錄獲得的以上IRES RNA 均經(jīng)酚-氯仿抽提純化后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

利用制備的生物素標(biāo)記和非標(biāo)記的FMDV IRES RNA 進(jìn)行pulldown 試驗(yàn)，具體操作為：收集長(zhǎng)滿(mǎn)單層的BHK-21 細(xì)胞于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min 后，取上清，加入Egg white avidin 和Yeast tRNA，4 ℃孵育20 min，去除內(nèi)源性非特異結(jié)合蛋白。12 000 r/min，4 ℃，離心10 min 后，取上清，加入200 U/mL RNasin 后分別與純化的非生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 和生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 混合，4 ℃孵育2 h，加入鏈霉親合素偶聯(lián)的磁珠，室溫孵育15 min。使用磁力架吸附磁珠，洗滌磁珠5 次，去除非特異結(jié)合蛋白。將蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE 分離考馬斯亮藍(lán)染色后，比較生物素標(biāo)記的IRES RNA 實(shí)驗(yàn)組與非生物素標(biāo)記的IRES RNA 對(duì)照組的條帶，切取差異條帶并送往中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析。

1.4 Western blot 檢測(cè)生物素標(biāo)記IRES RNA pulldown 樣品 參照1.3 方法，利用制備的IRSA RNA 在鼠源BHK-21 細(xì)胞，豬源IBRS-2 細(xì)胞和牛源pBK 細(xì)胞上分別進(jìn)行RNA pulldown 試驗(yàn)。將RNA pulldown 試驗(yàn)得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂乳封閉后，以兔抗eEF1a 多抗（1∶200）為一抗，山羊抗兔IgG-HRP（1∶3 000）為二抗，western blot 檢測(cè)eEF1a 蛋白。

1.5 激光共聚焦試驗(yàn)分析eEF1a 與FMDV IRES RNA 的相互作用 將FMDV O/YS/CHA/05 株（MOI 1）接種生長(zhǎng)至約90%單層的BHK-21細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)8 h后使用4%多聚甲醛常溫固定細(xì)胞20 min，0.5%Triton X-100 處理10 min，1%BSA 室溫封閉1 h。同時(shí)以鼠抗dsRNA MAb J2（1∶500）和兔抗eEF1a 多抗（1∶200）為一抗，山羊抗鼠IgG-TRITC（1∶500）和山羊抗兔IgG-FITC（1∶500）為二抗，DAPI（1∶2 000）復(fù)染細(xì)胞核后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察eEF1a 與FMDV IRES RNA 的相互作用。設(shè)置不接病毒細(xì)胞作為對(duì)照。

1.6 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 參照GenBank 中鼠 源eEF1a 基 因 序 列（NM_007906.3），設(shè) 計(jì) 引 物eEF1a-F 和eEF1a-R（表1）。利 用TRIzol 法 提 取BHK-21 細(xì)胞的總RNA，以經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，采用引物eEF1a-F/eEF1a-R 擴(kuò)增eEF1a 基因，利用同源重組法將eEF1a 基因片段克隆到經(jīng)EcoR I 和EcoR V 雙酶切的pcDNA-HA 真核表載體中獲得pcD?NA-HA-eEF1a 重組質(zhì)粒。以px458 質(zhì)粒為模板，使用引物EGFP-F/EGFP-R（參照質(zhì)粒px458 基因序列設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1）擴(kuò)增EGFP 片段，利用同源重組法將EGFP 基因片段克隆到經(jīng)EcoR I 和EcoR V 雙酶切后的pcDNA-HA 載體中構(gòu)建pcDNA-HA-EGFP 重組質(zhì)粒。以上所得重組質(zhì)粒均經(jīng)PCR 和測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本研究中使用的PCR 引物Table 1 Primers used in this study

1.7 過(guò)表達(dá)eEF1a 蛋白對(duì)FMDV 復(fù)制的影響 分別 將2 μg 的pcDNA-HA-eEF1a、pcDNA-HA-EGFP和pcDNA-HA 質(zhì)粒使用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋至0.01 μg/μL，分別按照轉(zhuǎn)染試劑（μL）與DNA（μg）3∶1 的比例將轉(zhuǎn)染試劑與稀釋DNA 輕柔混合，靜置15 min 后分別轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)24 h 后感染FMDV O/YS/CHA/05 株（MOI 1），分別于感染后4 h、8 h 和12 h 收集感染細(xì)胞并反復(fù)凍融裂解，將收集的細(xì)胞裂解物以FMDV VP2 蛋白特異性MAb 4B2（1∶1 000）為一抗，馬抗鼠IgG-HRP（1∶3 000）為二抗，western blot 檢測(cè)FMDV VP2 蛋白。將收集的病毒樣品用DMEM 做連續(xù)10 倍系列稀釋?zhuān)飨♂尪热?00 μL 接種預(yù)先鋪滿(mǎn)單層BHK-21 細(xì)胞的96 孔板，相同稀釋度的病毒液做8 個(gè)重復(fù)，72 h 后觀察細(xì)胞病變，根據(jù)K?rber 法計(jì)算TCID50/mL 值。

2 結(jié) 果

2.1 生物素標(biāo)記IRES RNA pulldown 試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)RNA pulldown 試驗(yàn)得到的蛋白樣品經(jīng)12% SDSPAGE 分離后結(jié)果顯示，與非生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 對(duì)照組捕獲的蛋白條帶相比，生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 試驗(yàn)組在50 ku 處有1 條差異性條帶（圖1），表明捕獲到未知的與FMDV IRES 結(jié)合的宿主蛋白。差異蛋白條帶切膠回收后進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選出4 種可能與FMDV IRES RNA 存在相互作用的宿主蛋白，分別為eEF1a、RPS3、DDX5 和DDX3X（表2）。根據(jù)蛋白評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，選擇評(píng)分最高的eEF1a 蛋進(jìn)一步白進(jìn)行RNA-蛋白互作驗(yàn)證和功能性研究。

圖1 與FMDV IRES RNA 結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白的篩選結(jié)果Fig.1 Screening of the cellular proteins associated with FMDV IRES RNA

表2 與FMDV IRES RNA 結(jié)合的細(xì)胞蛋白的篩選Table 2 Identification of host proteins interacting with FMDV IRES RNA by Mass Spectrometric

2.2 eEF1a 蛋白與FMDV IRES RNA 特異性相互作用 使用eEF1a 蛋白的特異性抗體對(duì)在RNA pull?down 試驗(yàn)中與FMDV IRES RNA 結(jié)合的鼠源BHK-21細(xì)胞蛋白進(jìn)行western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA pulldown 樣品中存在eEF1a蛋白，而生物素未標(biāo)記的FMDV IRES RNA、Bio?tin-16-UTP 以及空白beads 這3 個(gè)對(duì)照樣品中均無(wú)此蛋白，表明eEF1a 蛋白與FMDV IRES RNA 特異性結(jié)合（圖2）。為進(jìn)一步研究FMDV 易感的其它種屬細(xì)胞中eEF1a 蛋白能否與FMDV IRES RNA 特異性結(jié)合，本研究選擇豬源IBRS-2 細(xì)胞和牛源pBK 細(xì)胞進(jìn)行RNA pulldown 試驗(yàn)，結(jié)果顯示，豬源和牛源eEF1a 蛋白與鼠源eEF1a 蛋白均可與FMDV IRES RNA 特異性結(jié)合（圖2）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)MDV 不同種屬易感細(xì)胞的eEF1a 蛋白均能夠與FMDV IRES RNA 特異性結(jié)合。

圖2 FMDV IRES RNA 與不同種屬易感細(xì)胞eEF1a 蛋白的結(jié)合Fig.2 Binding activity of FMDV IRES RNA with eEF1a derived from FMDV susceptible cellsofdifferent species

在FMDV 感染的情況下，用激光共聚焦顯微鏡觀察宿主細(xì)胞中eEF1a 蛋白與FMDV 基因組RNA 在細(xì)胞內(nèi)的共定位。結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV 感染后eEF1a蛋白從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)中，并與FMDV 基因組RNA 在細(xì)胞質(zhì)中形成共定位（圖3）。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，eEF1a 蛋白與FMDV IRES RNA 存在特異性相互作用。

圖3 在FMDV 感染的BHK-21 細(xì)胞中eEF1a 蛋白與FMDV RNA 共定位的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Co-localization of the eEF1a with FMDV RNA in the cytoplasm of FMDV-infected BHK-21 cells

2.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HA-eEF1a 和pcDNA-HA-EGFP，分別對(duì)兩個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eEF1a擴(kuò)增的eEF1a基因片段大小約為1.3 kb，pcDNA-HA-EGFP擴(kuò)增的EGFP 基因片段約為0.7 kb，與預(yù)期相符，而空載體pcDNA-HA 未擴(kuò)增出條帶（圖4）。序列測(cè)定結(jié)果顯示，目的基因序列以及閱讀框正確，表明eEF1a 和EGFP 基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

圖4 eEF1a 和EGFP 基因重組質(zhì)粒的PCR 鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmids containing genes of eEF1a and EGFP by PCR

2.4 過(guò)表達(dá)eEF1a 蛋白對(duì)FMDV 復(fù)制的影響B(tài)HK-21 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-HA-eEF1a、pcDNA-HAEGFP和pcDNA-HA 24 h后，以MOI 1的劑量感染FM?DV，分別于病毒感染4 h、8 h和12 h后收集樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在病毒感染8 h 后，pcDNA-HA 和pcDNA-HA-EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組的病毒滴度分別為4.83 logTCID50/mL 和4.66 logTCID50/mL， 而 過(guò) 表 達(dá)eEF1a 蛋白的細(xì)胞病毒滴度僅為3.66 log TCID50/mL（圖5A）。在病毒感染4 h、8 h 和12 h 后，過(guò)表達(dá)eEF1a 蛋白細(xì)胞中病毒蛋白VP2 的表達(dá)量明顯低于pcDNA-HA 和pcDNA-HA-EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組（圖5B）。表明，宿主蛋白eEF1a 過(guò)表達(dá)顯著抑制FMDV 的復(fù)制。

圖5 eEF1a 過(guò)表達(dá)抑制FMDV 的復(fù)制Fig.5 FMDV replication was inhibited by overexpression of eEF1a

3 討 論

為探索IRES 如何通過(guò)與宿主蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)FMDV 復(fù)制的調(diào)控，本研究利用生物素標(biāo)記的FMDV IRES RNA 為“誘餌”，通過(guò)RNA pulldown 技術(shù)在BHK-21 細(xì)胞中篩選得到與FMDV IRES RNA 具有潛在相互作用的宿主蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定獲得4 種宿主蛋白，分別為eEF1a、RPS3、DDX5 和DDX3X。進(jìn)一步的western blot 分析和激光共聚焦試驗(yàn)證實(shí)，eEF1a 蛋白與FMDV IRES RNA 存在特異性的相互作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)eEF1a 蛋白可以顯著抑制FMDV 的復(fù)制。

eEF1a 蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)合成因子之一，在活躍的分裂細(xì)胞中占可溶性蛋白的1%到4%[9]。eEF1a 蛋白的典型功能是以GTP 依賴(lài)的方式結(jié)合氨基酰tRNA（AA-tRNA），并在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中將其傳遞到核糖體上的A 位點(diǎn)[10]。此外，eEF1a 蛋白還參與錯(cuò)誤折疊蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期[11-12]。eEF1a 蛋白可作為輔助因子參與多種病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝。eEF1a 蛋白是HIV逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（RTC）的一部分，在HIV 復(fù)制的早期階段發(fā)揮了關(guān)鍵作用[13]。HIV Nef-eEF1a 相互作用有利于eEF1a 蛋白的核質(zhì)穿梭，并抑制應(yīng)激介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[14]。eEF1a 蛋白有利于病毒復(fù)制復(fù)合物（RPC）的組裝，促進(jìn)登革熱病毒的復(fù)制[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，eEF1a 與豬瘟病毒的NS5A 蛋白相互作用抑制該病毒的復(fù)制[16]。

FMDV 在流行過(guò)程中病毒的毒力及宿主嗜性經(jīng)常發(fā)生變異，然而有關(guān)FMDV 的致病機(jī)理尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室的研究表明，IRES 元件是FMDV 毒力和細(xì)胞嗜性的分子決定因素（未發(fā)表資料），因此研究FMDV IRES 與宿主蛋白之間的相互作用，對(duì)進(jìn)一步闡明FMDV 的致病機(jī)理就顯得尤為重要。本研究首次發(fā)現(xiàn)宿主蛋白eEF1a 與FMDV IRES RNA 相互作用，而且發(fā)現(xiàn)eEF1a 蛋白對(duì)FMDV 的復(fù)制具有負(fù)調(diào)控作用。本研究為深入了解IRES 介導(dǎo)的翻譯起始機(jī)制以及FMDV 在宿主體內(nèi)復(fù)制的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。