Numb1與ITGB1的相互作用在胃癌惡化和耐藥中的調(diào)控機(jī)制研究

陳 勇， 何冬雷， 周江浩， 梁月祥， 楊 丞

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 海南 ?？?570102)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加。目前手術(shù)是根治胃癌的最佳方法，但患者治療后的存活率仍然很低[1]。大多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)，因此探索新的胃癌治療靶點(diǎn)對(duì)于胃癌的治療至關(guān)重要。Numb1蛋白是一種能夠抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的銜接蛋白，在細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Numb1基因在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可能與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及耐藥的形成相關(guān)。ITGB1是介導(dǎo)細(xì)胞粘附、收縮性和運(yùn)動(dòng)性的細(xì)胞表面粘附分子，可促進(jìn)上皮細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1的高表達(dá)介導(dǎo)了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[2]。也有研究已經(jīng)證實(shí)，ITGB1在胃癌患者中表達(dá)量增加[3]。目前發(fā)現(xiàn)銜接蛋白 Numb1可能參與調(diào)節(jié) ITGB1影響細(xì)胞骨架的形成，但是具體的分子機(jī)制尚不清楚。綜上所述，Numb1與ITGB1在腫瘤增殖、遷移以及耐藥過(guò)程中有不可忽視的作用，二者之間是否存在相互作用共同促進(jìn)胃癌的發(fā)展有待進(jìn)一步研究，其可能存在的結(jié)合位點(diǎn)也尚未得到驗(yàn)證。本研究擬通過(guò)胃癌臨床標(biāo)本及胃癌細(xì)胞株，分析Numb1對(duì)ITGB1的調(diào)節(jié)作用，研究Numb1與ITGB1的相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲力和耐藥性的影響，明確Numb1是否通過(guò)ITGB1實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及耐藥的調(diào)節(jié)，為胃癌患者的提供可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料：選取2019年2月至2021年6月手術(shù)切除的胃癌及其癌旁組織21例。手術(shù)取材后立即置于液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。所有患者均已簽署知情同意書(shū)。人胃癌細(xì)胞BGC-823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；奧沙利鉑(國(guó)藥準(zhǔn)字H20093541)購(gòu)自江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶消化液、胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；免疫沉淀試劑盒購(gòu)自賽默飛公司；過(guò)表達(dá)Numb1、ITGB1的重組慢病毒液和陰性對(duì)照重組慢病毒購(gòu)自上海吉滿生物科技有限公司；si-NC、si-ITGB1、si-Numb1購(gòu)自蘇州貝信公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；2×SYBR Green qPCR MasterMix購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Numb1、ITGB1和GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自中國(guó)Corning公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株BGC-823，置于37℃、5%CO2恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度更換新鮮的培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度到達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行消化和傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BGC-823細(xì)胞接種于6孔板(5×105個(gè)/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為flag-NC組(轉(zhuǎn)染flag-NC)、flag-Numb1組(轉(zhuǎn)染flag-Numb1)、flag-ITGB1組(轉(zhuǎn)染flag-ITGB1)。根據(jù)MOI值計(jì)算每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù))/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至1mL/孔。24h后，更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選。72h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將BGC-823細(xì)胞分為si-NC組、si-ITGB1組、si-Numb1組。按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。調(diào)整BGC-823數(shù)量并接種于6孔板，使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)70%左右生長(zhǎng)密度。制備si-Notch1、si-Numb1與脂質(zhì)體的復(fù)合物，同時(shí)制備無(wú)干擾作用的si-RNA(si-NC)與脂質(zhì)體復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)si-NC組、si-ITGB1組、si-Numb1組的孔內(nèi)，搖動(dòng)混合，5～6h將細(xì)胞培養(yǎng)基倒掉，PBS洗滌細(xì)胞2次，更換為RPMI 1640培養(yǎng)基，24h后更換培養(yǎng)液。

1.2.4qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Numb1、ITGB1的表達(dá)：TRIzol試劑提取各組細(xì)胞中的總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反體系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃(30s)預(yù)變性后，變性95℃(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40個(gè)循環(huán)周期。擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物序列：GAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，GAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；Numb1-F，5-AGGCTTCTTTGGAAAAACTGGA-3,Numb1-R，5-CGGGTGCTAGAGCAGTATGG-3；ITGB1-F，5-CGCCGCGCGGAAAAGATG-3，ITGB1-R，5-AAACACCAGCAGCCGTGTAA-3。

1.2.5WB法檢測(cè)細(xì)胞中Numb1、ITGB1的表達(dá)：收集各組胃癌細(xì)胞，向細(xì)胞中加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞上清液并測(cè)定其蛋白濃度。取30μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作。使用5%脫脂奶粉室溫孵育2h以去除非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入Numb1抗體(1∶1000)、ITGB抗體(1∶2000)，于4℃條件下孵育過(guò)夜。加入特異性二抗(1∶5000)，室溫條件下孵育1h后，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.6免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞中Numb1和ITGB1結(jié)合情況：將flag-NC、flag-ITGB1、flag-Numb1三組BGC-823細(xì)胞擴(kuò)增至100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度至70%以上時(shí)，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，裂解20min。12000g離心10min后取收集上清。在flag抗體與Protein G磁珠中加入上清液共孵育過(guò)夜。隔天依次將flag結(jié)合蛋白洗脫至新的EP管。加入SDS上樣緩沖液，100℃煮10min。上述樣品用12%的SDS-PAGE電泳，并進(jìn)行WB分析。

1.2.7CCK8細(xì)胞毒性試驗(yàn)：用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞后離心，用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度至8000個(gè)/孔，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)至24h、48h時(shí)每孔加入20μL CCK8溶液，2h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm吸光度(A)值。

1.2.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：各組細(xì)胞培養(yǎng)24h，使用胰蛋白酶消化，將密度調(diào)整為1×105個(gè)細(xì)胞/孔平鋪于6孔板上。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。使用200μL無(wú)菌槍頭輕輕劃過(guò)6孔板，每次平行劃5次左右。將處理后的6孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下觀察劃痕閉合度。通過(guò)Image J系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞遷移面積。

1.2.9Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取50μL基質(zhì)膠鋪于8μm Transwell小室內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱靜置1h。取各組細(xì)胞，胰酶消化后離心，后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×104/mL，接種于Transwell小孔上室，每孔200μL。下室加入500μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，用4%的多聚甲醛固定15min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，PBS清洗后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達(dá)水平比較：采用qRT-PCR檢測(cè)胃癌腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達(dá)水平，結(jié)果顯示與癌旁組織比較，腫瘤組織中Numb1和ITGB1表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Numb1和ITGB1的表達(dá)水平成正相關(guān)(r=0.6270)見(jiàn)圖1B。

圖1 胃癌組織Numb1和ITGB1表達(dá)水平比較

2.2Numb1與ITGB1蛋白在胃癌細(xì)胞中相互結(jié)合：通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞中Numb1和ITGB1結(jié)合情況，結(jié)果顯示，全細(xì)胞裂解液中，與flag-NC比較，過(guò)表達(dá)flag-ITGB1組Numb1蛋白表達(dá)水平增加；過(guò)表達(dá)flag-Numb1組Numb1蛋白表達(dá)水平增加，說(shuō)明過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。在過(guò)表達(dá)flag-Numb1的flag免疫沉淀產(chǎn)物中可檢測(cè)到ITGB1蛋白，在過(guò)表達(dá)flag-ITGB1的flag免疫沉淀產(chǎn)物中可檢測(cè)到Numb1蛋白，而在過(guò)表達(dá)flag-NC的flag免疫沉淀產(chǎn)物中均不能檢測(cè)到Numb1和ITGB1蛋白。結(jié)果說(shuō)明Numb1與ITGB1蛋白之間存在直接或間接的相互作用，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫共沉淀檢測(cè)胃癌細(xì)胞Numb1和ITGB1結(jié)合情況

2.3Numb1在胃癌細(xì)胞中調(diào)控ITGB1表達(dá)：qRT-PCR和WB結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組Numb1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；與si-NC組比較，si-ITGB1組ITGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)染成功。與si-NC組比較，si-Numb1組ITGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，而si-ITGB1組Numb1的mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性變化(P>0.05)，見(jiàn)圖3A和3B。

圖3 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)研究Numb1與ITGB1表達(dá)調(diào)控關(guān)系

2.4沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌細(xì)胞增殖：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細(xì)胞增殖能力降低，在72h時(shí)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 CCK8檢測(cè)沉默Numb1和ITGB1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力影響

2.5沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌細(xì)胞遷移和侵襲：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細(xì)胞24 h遷移率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖5。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組細(xì)胞侵襲數(shù)目均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Numb1和ITGB1對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力影響

圖6 Transwell檢測(cè)沉默Numb1和ITGB1對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力影響

2.6沉默Numb1和ITGB1促進(jìn)奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷能力：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Numb1組和si-ITGB1組經(jīng)不同濃度(10、20、50、100μmoL/L)奧沙利鉑處理胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均降低，在(150、100μmoL/L)濃度下具有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度奧沙利鉑對(duì)各組胃癌細(xì)胞存活率的影響

3 討 論

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率估算數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌發(fā)病率為5.7%，死亡率為8.2%，是世界范圍內(nèi)第三大癌癥相關(guān)死亡原因。胃癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及多藥物耐藥是化療成功的主要障礙，其結(jié)果是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物治療的敏感性降低且極易復(fù)發(fā)。

Numb蛋白首先在果蠅中被鑒定和研究，是一種與細(xì)胞內(nèi)膜相連的磷酸酪氨酸結(jié)合域蛋白。Numb又稱(chēng)細(xì)胞命運(yùn)決定因子，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要的作用[4]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了Numb家族蛋白與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，Numb可與p53、Notch等相互作用以調(diào)節(jié)它們?cè)谀[瘤過(guò)程中的活性。例如Numb6可誘導(dǎo)胚胎轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)，進(jìn)而主動(dòng)抑制E-鈣粘蛋白，促使細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞失去其上皮表型，表現(xiàn)出促遷移和促侵襲行為[5]。Numb1是Numb的一個(gè)亞型，大多數(shù)研究已將Numb1確定為一種腫瘤抑制因子，在結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌中經(jīng)常被下調(diào)[6]，然而也有研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，Numb的高表達(dá)與腫瘤高復(fù)發(fā)率和較差的總體術(shù)后生存率顯著相關(guān)，敲除食管鱗狀細(xì)胞系中的Numb1時(shí)，caspase-3依賴(lài)性細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖抑制持續(xù)增加，癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，這表明Numb1可能促進(jìn)癌癥的發(fā)展[7]。但是Numb1在胃癌中的作用尚缺乏相關(guān)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，腫瘤組織中Numb1表達(dá)水平升高。說(shuō)明Numb1可能參與胃癌的發(fā)展。

整合素參與細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用以及癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，通過(guò)直接與上皮細(xì)胞間充質(zhì)基質(zhì)成分結(jié)合并提供細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲所需的牽引力，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)以及遷移能力方面發(fā)揮著重要作用。ITGB1是主要的整合素β亞基，被稱(chēng)為癌癥預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物[8]。Oshita等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1可通過(guò)形成各種α2β1、α3β1、α6β1和αvβ1整合素來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，從而促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。在胃癌患者的腫瘤組織中，ITGB1的表達(dá)上調(diào)，能夠增強(qiáng)細(xì)胞遷移率和增殖能力，而沉默ITGB1可以逆轉(zhuǎn)這種作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往所述一致，與癌旁組織比較，腫瘤組織中ITGB1表達(dá)水平升高，ITGB1可能促進(jìn)胃癌的發(fā)展。

已有研究顯示，Numb通過(guò)其PTB結(jié)構(gòu)域與ITGB1相互作用，調(diào)節(jié)ITGB1的內(nèi)化從而影響細(xì)胞骨架形成。Martinez-Morales[10]等研究團(tuán)隊(duì)利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)也證明Numb的PTB結(jié)構(gòu)域可以與ITGB1發(fā)生相互作用，并且能夠調(diào)節(jié)ITGB1在細(xì)胞中的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)ITGB1與Numb1的表達(dá)量呈正相關(guān)性，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了Numb1與ITGB1蛋白之間存在直接或間接的相互作用。當(dāng)沉默Numb1后ITGB1的表達(dá)下調(diào)，但是沉默ITGB1不會(huì)影響Numb1的表達(dá)，這表明Numb1可在胃癌細(xì)胞中調(diào)控ITGB1表達(dá)。癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力使其能夠改變組織內(nèi)的位置并脫離原發(fā)性腫瘤，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲對(duì)于癌癥的治療至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默Numb1與ITGB1后胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力均下降，說(shuō)明沉默Numb1與ITGB1可能通過(guò)抑制癌細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移來(lái)抑制癌癥的發(fā)展。

多藥物耐藥(Multi-drug resistent,MDR)是導(dǎo)致胃癌不可治愈的重要原因,奧沙利鉑是晚期胃癌治療的一線藥物，而對(duì)其的耐藥性是導(dǎo)致臨床治療失敗的主要問(wèn)題[11]。胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期改變和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路信號(hào)活化的改變以及細(xì)胞骨架改變是胃癌耐藥發(fā)生的主要機(jī)制。ITGB1的作用可導(dǎo)致p27Kip1在胞內(nèi)累積，引起細(xì)胞周期異常是導(dǎo)致耐藥的重要原因，這些生物學(xué)事件共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)沉默ITGB1會(huì)促進(jìn)奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷能力，而同時(shí)沉默Numb1和ITGB1將進(jìn)一步加強(qiáng)藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用，表明抑制Numb1和ITGB1會(huì)降低腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌藥物的耐藥性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及耐藥發(fā)生發(fā)展的具體生物學(xué)過(guò)程，并且確認(rèn)Numb1在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及耐藥形成過(guò)程中的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)也將為解決胃癌的臨床復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥提供新的理論依據(jù)。