STING 蛋白在綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的表達(dá)與生物信息學(xué)分析

郝秀靜，韓 楊，潘群元，金 華，馬春驥，羅海霞，李 敏*

（1. 寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

干擾素基因刺激因子（Stimulator of inerferon gene，STING）作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的固有免疫信號(hào)通路關(guān)鍵接頭蛋白，在機(jī)體抵抗病原體侵入過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。當(dāng)機(jī)體被感染時(shí)，STING 可直接識(shí)別病原體釋放的環(huán)二核苷酸（Cyclic di-nucleotides，CDNs），使自身活化，并募集TANK 結(jié)合激酶（TBK1）形成復(fù)合物， 該復(fù)合物進(jìn)一步激活干擾素刺激因子3（IRF-3）并使其磷酸化后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN及IFN 刺激基因（Interferon stimulate genes，ISG）的表達(dá)，激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)[3-5]。由環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶（cGAS）合成的cGAMP 是真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中DNA 的主要傳感器之一，也可以激活STING 信號(hào)通路[6-8]。此外，位于細(xì)胞核或者線粒體中的自體DNA一旦泄露到細(xì)胞質(zhì)中，STING 可能會(huì)被過(guò)度激活引起自身免疫性疾病[9]。2018 年Ahn 等人的研究還發(fā)現(xiàn)STING 信號(hào)通路在抗腫瘤免疫中也發(fā)揮著重要的作用，為腫瘤治療提供了一個(gè)新方案[10]。

目前在哺乳動(dòng)物如人和小鼠中發(fā)現(xiàn)STING 蛋白在 其N 端（aa1～aa137）包 含4 個(gè) 跨 膜 區(qū) 域，C 端（aa138～aa397）延伸至胞質(zhì)中，可以感知胞漿中的二核苷酸以及招募下游相關(guān)因子[11]。STING 一般以二聚體的形式存在，STING 蛋白的活化、抑制或者過(guò)度激活與該聚合體的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[12]。人的STING蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，當(dāng)STING 被活化后，其構(gòu)象發(fā)生變化，并募集TBK1，形成STING 復(fù)合體，該復(fù)合體發(fā)生膜運(yùn)輸，經(jīng)過(guò)高爾基體到達(dá)核周。但有關(guān)綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中的STING 蛋白還未見(jiàn)報(bào)道。寧夏地處西北，養(yǎng)殖業(yè)資源豐富，綿羊是其主要的養(yǎng)殖物種，但疾病的發(fā)生阻礙了綿羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，特別是羊傳染性胸膜肺炎的發(fā)生給羊養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)綿羊抗感染相關(guān)基因的探究特別是針對(duì)其呼吸道第一道防線——綿羊肺泡巨噬細(xì)胞中抗感染基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于該病的防控具有重要意義。為此，本研究首先證明了綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中含有sting 基因，明確了STING 蛋白在綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)；利用免疫熒光技術(shù)以及激光共聚焦對(duì)STING 蛋白進(jìn)行定位，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)深入研究STING 蛋白在綿羊肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)揮固有免疫作用的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 載體購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI、T4 連接酶、IPTG、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqPCR Master Mix 試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000 DNA Marker 等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)股份有限公司；酵母提取物（Yeast extract）、胰蛋白酶（Tryptone）購(gòu)自O(shè)XOID 公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司；Protein Marker 購(gòu)自全式金（北京）有限公司；FITC 標(biāo)注的抗CD14 抗體（人源）購(gòu)自Abcam 公司；兔抗TMEM173/STING 多克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG、鼠抗ERp72 單克隆抗體（MAb）、Alexa Fluor488山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG 購(gòu)自Proteintech公司；底物顯色試劑盒購(gòu)自GE 公司。

1.3 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純度鑒定 取新鮮的6 月齡的綿羊肺臟組織，通過(guò)其氣管頂部灌入含有2.5 μg/mL 兩性霉素B、100 μg/mL 氨芐青霉素、25 μg/mL 慶大霉素的PBS 緩沖液，待肺葉膨脹后輕輕按摩肺葉，然后將肺臟灌洗液經(jīng)氣管頂部倒出，并用兩層已滅菌的醫(yī)用紗布將其過(guò)濾至無(wú)菌瓶中，900 r/min 離心5 min，取沉淀物置于20%胎牛血清的DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，于37 ℃5%CO2培養(yǎng)，每1 h～2 h 更換培養(yǎng)基。利用顯微鏡對(duì)分離培養(yǎng)的已貼壁細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。制備細(xì)胞爬片，以FITC 標(biāo)記的抗肺泡巨噬細(xì)胞表面特異性抗原CD14 的抗體（1∶100）對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，DAPI 避光孵育5 min 進(jìn)行核染，通過(guò)熒光顯微鏡觀察并鑒定分離的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的純度。

1.4 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞sting 基因的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 提取綿羊原代巨噬細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為PCR 模板,采用上下游引物：stingF：ATGCCTCACTCCAGCCTGCAT/ stingR： TCAGAAGACATCTGAGCGGA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃1 min，62 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收連接于pMD18-T 載體，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.5 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中STING 蛋白的western blot 鑒定 提取已分離鑒定的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞總蛋白，使用BCA 檢測(cè)試劑盒對(duì)所提蛋白濃度測(cè)定后，以兔抗TMEM173/STING 多克隆抗體（1∶1 000）為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定細(xì)胞中的STING 蛋白。

1.6 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中STING 蛋白的定位檢測(cè) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將5×104個(gè)/mL細(xì)胞接種于200 mm激光共聚焦小皿，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，0.5%Triton X-100 室溫通透20 min，封閉30 min 后以兔抗TMEM173/STING 多克隆抗體（1∶1 000）與鼠抗ERp72 MAb（1∶1 000）為一抗，以Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶500）和Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）為二抗，37 ℃孵育1 h，滴加DAPI 避光孵育5 min，激光共聚焦顯微鏡下選取多個(gè)視野觀察并采集圖像。

1.7 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中STING 蛋白的生物信息學(xué)分析 使用生物信息學(xué)SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）軟 件 對(duì)STING 蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行分析；利用生物信息學(xué)軟件HMMER （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 對(duì)STING 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用生物信息學(xué)軟件Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/）對(duì)STING 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純度鑒定將分離的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，通過(guò)反復(fù)換液的方式，去除未貼壁的細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡觀察可見(jiàn)分離獲得的細(xì)胞具典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，胞體較大，呈圓形或橢圓形，有偽足和突起伸出。對(duì)分離的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞加入FITC標(biāo)記的抗CD14的抗體進(jìn)行標(biāo)記，與細(xì)胞核染結(jié)果重疊對(duì)比，結(jié)果顯示，分離的細(xì)胞基本被CD14的抗體標(biāo)記（圖1）。表明，分離得到了純度較高的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞。

圖1 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的鑒定結(jié)果Fig.1 Dentification of primary alveolar macrophages in sheep

2.2 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞sting 基因及蛋白的檢測(cè)結(jié)果 以綿羊肺泡巨噬細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，結(jié)果顯示擴(kuò)增的基因片段約1 100 bp，與預(yù)期一致（圖2A）；測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)序基因序列與sting 基因序列一致。表明綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中存在sting 基因。通過(guò)western blot 對(duì)綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞STING 蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在40 ku 處有目的蛋白條帶，與預(yù)期相符（圖2B）。表明綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中STING 蛋白得到了表達(dá)。

圖2 sting 基因的PCR 擴(kuò)增（A）及其蛋白的westenblot 鑒定（B）結(jié)果Fig.2 PCR amplification of the sting gene(A)and westen blot identification(B)of the target protein

2.3 STING 蛋白在綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中的定位檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中的STING 蛋白進(jìn)行定位，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果可見(jiàn)STING 蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性標(biāo)記蛋白ERp72 相重疊（圖3），初步認(rèn)為STING 蛋白定位在綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.4 綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中STING 蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果 經(jīng)SignalIP5.0 軟件對(duì)STING 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示該蛋白aa1～aa37 之間存在信號(hào)肽，其切割位點(diǎn)位于第38 位的谷氨酸（Glu）和第39位的脯氨酸（Pro）之間（圖4）。使用HMMER軟件對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示該蛋白存在TMEM173結(jié)構(gòu)域，有3個(gè)潛在跨膜區(qū)，分別是aa21～aa37、aa84～aa107、aa119～aa140。利用生物信息學(xué)軟件Swiss model 做STING 蛋白二聚體的三維結(jié)構(gòu)呈蝴蝶狀，與目前已報(bào)道的其他物種的STING蛋白二聚體結(jié)構(gòu)一致（圖5）。通過(guò)對(duì)STING 蛋白信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，可以為更加深入細(xì)致的研究STING 蛋白的定位奠定基礎(chǔ)；通過(guò)對(duì)STING蛋白結(jié)構(gòu)的分析，為后續(xù)深入探究STING蛋白在固有免疫中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖3 STING 蛋白在綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中定位的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Location of STING protein in primary alveolar macrophages of sheep

圖4 STING 蛋白的信號(hào)肽分析圖Fig.4 Signal peptide analysis of STING protein

圖5 STING 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Three-dimensional structure of STING protein

3 討 論

天然免疫是宿主抵御病原體感染的第一道防線，在機(jī)體抵抗病原體侵入中發(fā)揮重要作用[13]，天然免疫相關(guān)細(xì)胞通過(guò)其表面的模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式，激活機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，STING 蛋白作為重要的天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵接頭蛋白不僅在抗感染免疫中發(fā)揮著重要的作用，在自身免疫性疾病以及抗腫瘤的免疫中也發(fā)揮著重要作用[14-16]。部分學(xué)者認(rèn)為，活化的STING 也可磷酸化IKB 激酶（IKB Kinase，IKK）以解除NF-κB 的抑制狀態(tài)，從而上調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[17-18]。Muhammet F 等人研究顯示cGAS-STING 通路的激活會(huì)觸發(fā)原發(fā)性或惡性T 細(xì)胞的凋亡[19]。嬰兒期起病的血管?。⊿AVI）與STING 的6 個(gè)位點(diǎn)突變有關(guān)[12]。該蛋白在多種細(xì)胞中表達(dá)，其中與免疫相關(guān)的細(xì)胞表達(dá)量高。鑒于STING 蛋白功能的重要性，有待對(duì)STING 蛋白進(jìn)行更深入的研究。

綿羊傳染性胸膜肺炎嚴(yán)重影響了羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，綿羊肺泡巨噬細(xì)胞的抗感染相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與研究對(duì)于該病的防控具有重要意義。該細(xì)胞中的STING 蛋白目前還未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其進(jìn)行深入研究的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是獲取高純度的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞，在制備該細(xì)胞過(guò)程中，因?yàn)槭占姆闻K灌洗液中含有大量的紅細(xì)胞，本研究最初嘗試加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，但肺泡巨噬細(xì)胞的整體活性又受到影響，后來(lái)利用肺泡巨噬細(xì)胞貼壁的特性，通過(guò)多次換液去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的紅細(xì)胞，最終獲得了高純度的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞。

利用分離到的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞，通過(guò)PCR 檢測(cè)到該細(xì)胞中存在sting 基因。western blot 進(jìn)一步表明STING 蛋白在該細(xì)胞中的表達(dá)。但是關(guān)于STING 蛋白的定位仍然存在一些爭(zhēng)議，信號(hào)肽一方面決定一個(gè)蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，此外和蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)，經(jīng)Signal IP 5.0軟件對(duì)STING 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示該蛋白aa1～aa37 之間存在信號(hào)肽。利用免疫熒光技術(shù)經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，初步明確了綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞中的STING 蛋白定位在該細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。本研究為深入探索STING 蛋白在綿羊肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)揮固有免疫作用的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。