大紅火龍果花粉離體萌發(fā)條件的優(yōu)化及其活力測定方法篩選

孫佩光，程志號，李洪立，孫長君，郭素霞，丁哲利，吳 瓊*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 海口 571010； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?570100)

火龍果〔Hylocereusundatus(Haw.)Britt. et Rose〕又名紅龍果、仙蜜果、龍珠果，屬仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)[1]?；瘕埞鳛橐环N新興熱帶水果在我國的栽培歷史較短，生產(chǎn)上的栽培品種主要來自中國臺灣和越南，存在品種老化、自交不親和、需要人工授粉等問題[2-4]。此外，火龍果在自然授粉條件下存在落花落果嚴(yán)重、單果重小、經(jīng)濟(jì)價值不高等問題。戴雪香[5]報道，火龍果單株開花量平均為15朵，在自然授粉時約有47.71%花蕾在花后脫落。異花授粉能夠顯著降低落花率、提高座果率和單果重、促進(jìn)果實發(fā)育，并且還可以改善果肉顏色、果實品質(zhì)和風(fēng)味等[6-8]，而決定異花授粉成功的關(guān)鍵是花粉萌發(fā)率(生產(chǎn)中采用培養(yǎng)基測定的為花粉萌發(fā)率)/花粉活力(生產(chǎn)中采用染色法進(jìn)行測定的為花粉活力)。

花粉萌發(fā)率/花粉活力低，花粉管生長緩慢將無法完成受精或授粉受精不良；花粉萌發(fā)率/花粉活力高，花粉管能夠快速伸長到達(dá)子房完成授粉受精過程[9]。而花粉萌發(fā)率/花粉活力高低除與自身質(zhì)量相關(guān)外，還與萌發(fā)時蔗糖、硼酸、pH、生長調(diào)節(jié)劑等環(huán)境條件密切相關(guān)[10-12]。因此，人為輔助改善火龍果花粉萌發(fā)條件以期提高其授粉受精能力至關(guān)重要。目前關(guān)于花粉萌發(fā)條件優(yōu)化的報道多集中于梨[10]、桃[9]等大眾果樹，火龍果的相關(guān)研究較少。

花粉萌發(fā)率/花粉活力直接決定了火龍果坐果率和產(chǎn)量，準(zhǔn)確測定花粉萌發(fā)率/花粉活力對于豐產(chǎn)栽培、雜交育種以及果實品質(zhì)改良等具有重要意義?；ǚ勖劝l(fā)率的測定采用離體萌發(fā)法進(jìn)行，該方法準(zhǔn)確率高，但是耗時較長。染色法測定的花粉活力耗時短，但存在已染色但不萌發(fā)的現(xiàn)象。對于火龍果花粉活力的研究已有少量報道，但由于測定方法、品種差異、栽培措施和萌發(fā)條件等差異，所得的研究結(jié)果不同。胡子有等[13]用形態(tài)觀察法檢測紅皮紅肉和紅皮白肉火龍果的花粉活力均在90%以上；林平等[14]采用碘-碘化鉀(I2-KI)染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定紅皮紅肉火龍果的花粉活力為40%～70%；謝穗紅等[15]利用離體萌發(fā)法測定(培養(yǎng)基含25%蔗糖+ 0.05%硼酸)白玉龍、珠龍火龍果和霸王花的花粉萌發(fā)率分別為61.38%、58.95%和 52.81%；王玉林等[12]使用液體培養(yǎng)基測定紅皮紅肉火龍果的花粉活力最高，為65.76%。

目前，鮮見采用離體萌發(fā)法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法等多種方法對比分析火龍果花粉萌發(fā)率/花粉活力的系統(tǒng)報道。對影響花粉萌發(fā)條件的蔗糖濃度、硼酸濃度和培養(yǎng)基pH等條件進(jìn)行優(yōu)化，探索適宜大紅火龍果花粉萌發(fā)的適宜條件和培養(yǎng)基組分，并在此基礎(chǔ)上運用不同方法測定大紅火龍果的花粉活力，篩選準(zhǔn)確、快速測定火龍果花粉活力的最佳方法，以期為大紅火龍果人工授粉及其豐產(chǎn)栽培、雜交育種以及果實品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大紅火龍果(Hylocereusmonacanthus)花粉采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所實驗基地。2019年9-0月于花朵開放前，選擇無病蟲害、生長一致的5～6朵花帶回實驗室水培，待到20:30-21:30花朵全部綻放時，使用毛筆輕輕掃落花粉粒于硫酸紙上，收集5～6朵花的花粉并等量混勻，用毛筆蘸取少許花粉，播撒在不同的蔗糖濃度梯度、硼酸濃度梯度和pH梯度的培養(yǎng)基上，28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以上。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設(shè)計 依次對蔗糖濃度、硼酸濃度和pH 3個因素進(jìn)行篩選和優(yōu)化?；ǚ勖劝l(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (BK1) 組成為硼酸(H3BO4)100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1g/L + 1%瓊脂，pH6.5，以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別進(jìn)行蔗糖濃度和硼酸濃度的篩選。蔗糖梯度設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%、30%等6個梯度，硼酸濃度設(shè)置100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L 6個硼酸梯度；根據(jù)上述試驗篩選出花粉萌發(fā)率高且有利于花粉管生長伸長的最適蔗糖濃度、硼酸濃度，并將最適宜的蔗糖濃度和硼酸濃度帶入基礎(chǔ)培養(yǎng)基 BK1中配置成培養(yǎng)基BK2，使用手持式pH計測定未調(diào)pH時的BK2培養(yǎng)基pH為6.7，因此pH設(shè)6.0、6.7、7.0和8.0 4個梯度。每個處理3個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿至少觀察3個視野。萌發(fā)花粉以花粉管超過花粉粒直徑為萌發(fā)，花粉萌發(fā)率用以下公式計算：

1.2.2 不同染色法測定火龍果花粉生活力的比較 TTC染色法測定花粉活力參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行；I2-KI測定花粉活力參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行；醋酸洋紅測定花粉活力參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行；亞歷山大紅測定花粉活力方法參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。將不同測定方法的火龍果花粉活力計數(shù)，每處理觀察3個載玻片，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用Excel 2007和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對大紅火龍果花粉萌發(fā)率的影響

2.1.1 蔗糖濃度 從封3圖版Ⅰa～f可知不同蔗糖濃度處理的大紅火龍果花粉萌發(fā)情況。從圖1可知，低濃度的蔗糖對花粉萌發(fā)率的促進(jìn)作用不明顯。 5%濃度梯度下花粉萌發(fā)率較低，為(18.62 ± 2.31)%(封3圖版Ⅰ a)。隨著蔗糖濃度梯度增加，大紅火龍果花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先增后減的單峰型變化；蔗糖濃度為15%時，花粉活萌發(fā)率最高，為(54.68±4.46)%，該條件下的花粉管生長較長(封3圖版Ⅰ c)；高濃度蔗糖(25%)培養(yǎng)基上花粉管生長和伸長受到抑制，尤其是30%蔗糖濃度時表現(xiàn)尤為明顯(封3圖版Ⅰ e，f)。蔗糖濃度為15%和20%時花粉萌發(fā)率無顯著差異，但二者與其他濃度蔗糖處理的花粉萌發(fā)率差異極顯著，從提高花粉萌發(fā)率的角度宜選15%蔗糖濃度。

注：圖中不同大小寫字母表示差異極顯著(P< 0.01)和顯著(P< 0.05)，下同。

Note: Differentcapital and lowercase letters mean significantly different atP<0.01 andP<0.05 levels, respectively. The same below.

圖1 不同蔗糖濃度處理大紅火龍果的花粉萌發(fā)率

Fig.1 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different sucrose concentrations

2.1.2 硼酸濃度 從圖2和封3圖版Ⅰg～m可知，在硼酸濃度為100 mg/L時，大紅花粉萌發(fā)率較低；隨著硼酸濃度梯度增加，花粉萌發(fā)率在一定程度上呈增加趨勢；在硼酸濃度為700 mg/L時花粉萌發(fā)率最高，為(43.90±6.27)%。硼酸濃度為500 mg/L和700 mg/L的花粉萌發(fā)率差異顯著；硼酸濃度為700 mg/L時的花粉萌發(fā)率與900 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L的花粉萌發(fā)率無顯著差異。然而高濃度的硼酸容易造成大紅火龍果花粉內(nèi)含物外溢，且花粉管生長受抑制，較高濃度的硼酸容易引起花粉管變粗，并嚴(yán)重抑制花粉管伸長(封3圖版Ⅰ k～m)。因此，大紅火龍果離體萌發(fā)較適宜的硼酸濃度為700 mg/L。

Fig.2 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different boric acid concentrations

2.1.3 培養(yǎng)基pH 從圖3可知，培養(yǎng)基溶液pH為7.0時，花粉萌發(fā)率最高，為(45.77±4.82)%；而pH6.7時花粉萌發(fā)率次之，為(43.9±6.27)%；pH7.0與pH6.7的花粉萌發(fā)率無顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)基溶液pH6.0或pH8.0時，花粉的萌發(fā)率均低于40%。pH6.7、pH7.0的花粉萌發(fā)率與pH6.0、pH8.0的花粉萌發(fā)率差異極顯著。pH6.7的培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)時很少發(fā)生內(nèi)含物外溢現(xiàn)象，花粉管伸長也未受明顯抑制；而pH7.0的培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)時存在許多內(nèi)含物溢出現(xiàn)象，其花粉管前部呈現(xiàn)螺旋狀或卷曲狀不生長等現(xiàn)象，且花粉管長度明顯較短(封3圖版Ⅰ o～q)。因此，從促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長的角度，離體萌發(fā)法培養(yǎng)基的pH宜選擇pH6.7。

Fig.3 Pollen germination rate ofH.monacanthuson medium with different pH

2.2 不同方法測定大紅火龍果的花粉活力

從封3圖Ⅱa～e可知不同方法測定大紅火龍果的花粉染色情況/萌發(fā)情況。從圖4可知，不同方法測定大紅火龍果的花粉萌發(fā)率依次為離體萌發(fā)法>醋酸洋紅染色法>TTC染色法>I2-KI染色法>亞歷山大紅染色法。離體萌發(fā)法與醋酸洋紅染色法測定的花粉活力無顯著差異，離體萌發(fā)法與I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法測定的花粉活力差異達(dá)極顯著水平。因此，在同時考察火龍果花粉萌發(fā)率和花粉管生長速度時應(yīng)首選離體萌發(fā)法，而準(zhǔn)確測定其花粉活力的方法，優(yōu)選醋酸洋紅染色法。

注：YS為亞歷山大紅染色法，CS為醋酸洋紅染色法，DK為I2-KI染色法，TT為TTC染色法，IV為離體萌發(fā)法。

Note: YS is Alexander red staining; CS is Carmine acetate staining; DK is I2-KI staining; TT is TTC staining; IV is in vitro germination.

圖4 不同方法測定大紅火龍果的花粉活力

Fig.4 Pollen viabilities ofH.monacanthusdetected by different methods

3 結(jié)論與討論

蔗糖是花粉管細(xì)胞分裂和生化過程中主要碳源及營養(yǎng)物質(zhì)來源；硼元素則參與了花粉管壁的形成、花粉管的囊泡運輸、碳水化合物吸收以及酚類物質(zhì)的代謝等一系列生理生化過程[20]。已有研究表明，含有10%蔗糖和0.01%硼酸的固體培養(yǎng)基有利于桃、杏花粉的萌發(fā)和花粉管的生長[9,21-22]；而梨、篤斯越桔等果樹花粉萌發(fā)需要10%～15%的蔗糖和300 mg/L的硼酸[10,23]。高賽等[24]報道，‘秦冠’蘋果花粉在含有20%蔗糖和0.01%硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高；甜櫻桃花粉萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基含有20%的蔗糖和0.1%硼酸[25]。謝穗紅等[15]報道，一些品種的火龍果和霸王花花粉在25%的蔗糖+ 500 mg/L硼酸培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高；王玉林等[12]報道火龍果花粉在含有35%蔗糖 + 600 mg/L硼酸 + pH 6.7的液體培養(yǎng)基上萌發(fā)最好，而在含有30%蔗糖 +400 mg/L硼酸 + pH 7.5的培養(yǎng)基上花粉管生長最長。研究表明，大紅火龍果花粉在含有15%蔗糖和700 mg/L硼酸培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，且花粉管生長較好。大紅火龍果花粉萌發(fā)時對蔗糖的需求與大多數(shù)果樹相似，但對硼酸的需求遠(yuǎn)高于其他果樹品種。研究結(jié)果與桃[9]、‘嘎啦’蘋果[26]、梨[27]等果樹上研究證實高濃度的蔗糖抑制花粉萌發(fā)結(jié)論一致?？赡苁歉邼舛鹊恼崽侨菀滓鸹ǚ墼|(zhì)體質(zhì)壁分離[28]，導(dǎo)致花粉快速失去活性而不能正常萌發(fā)。

梨[10]、蘋果[26]、篤斯越桔[23]、甜櫻桃[25]等果樹花粉萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基pH為6.5～6.8。王玉林等[12]報道培養(yǎng)基pH6.5時火龍果萌發(fā)效果較好，而培養(yǎng)基pH7.5時對花粉管伸長具有促進(jìn)作用。研究表明，在pH6.7的培養(yǎng)基上，最適宜大紅火龍果萌發(fā)和花粉管伸長。研究結(jié)果與王玉林等[12,15]研究結(jié)果不太一致，可能與品種差異、培養(yǎng)基組成成分不同和花粉萌發(fā)條件不同等因素有關(guān)。

大紅火龍果花粉離體萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基組成為Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1 g/L+ 15%蔗糖+ 700 mg/L硼酸 + 1%瓊脂，pH6.7。在此基礎(chǔ)上，可通過調(diào)整蔗糖濃度、硼酸濃度和pH，得到其他品種的火龍果花粉萌發(fā)的較適宜條件。離體萌發(fā)法與醋酸洋紅染色法測定的花粉活力無顯著差異，而與I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法測定的花粉活力差異極顯著。在考察大紅火龍果花粉萌發(fā)率和花粉管生長情況時應(yīng)首選離體萌發(fā)法，準(zhǔn)確測定其花粉活力時優(yōu)選醋酸洋紅染色法。