杜鵑蘭化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進展

王 靜，肖紅琴，李 瑩，胡賀佳，鞏仔鵬，鄭 林，王愛民，李勇軍，李月婷*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

杜鵑蘭〔Cremastraappendiculata(D. Don) Makino〕屬我國蘭科的緊缺中藥材，又名算盤七、三七筍，其干燥假鱗莖為主要的入藥部位，性涼、味甘、微辛，被收載于《中國藥典》中[1]，常在各種方劑中作君臣佐使藥，如：紫金錠外敷治療靜脈炎時，杜鵑蘭以散結(jié)瀉熱的功效作為君藥[2]。菊藻丸聯(lián)合化療治療中晚期胃癌時，杜鵑蘭以清熱解毒，軟堅散結(jié)的作用助菊花、金銀花等君藥，作為臣藥存在[3]。癃閉舒膠囊聯(lián)同中藥穴位貼敷治療前列腺增生時，杜鵑蘭以清熱解毒、利尿通淋的作用為佐藥使用[4]。杜鵑蘭在中藥配伍中起著重要作用，系統(tǒng)地研究杜鵑蘭化學(xué)成分、藥理作用對研究者開發(fā)新藥及中藥復(fù)方的臨床深入研究具有重要意義。目前，杜鵑蘭在化學(xué)成分、藥理作用和質(zhì)量控制方面的研究較多，已有的報道主要在化學(xué)成分及藥理作用方面。但不同的化學(xué)成分提取溶劑不同。目前，鮮見有關(guān)杜鵑蘭不同提取溶劑中化學(xué)成分及質(zhì)量控制的報道。為此，從杜鵑蘭不同提取溶劑提取的化合物、藥理作用及質(zhì)量控制3方面進行綜述，以期為杜鵑蘭有效成分的提取及臨床應(yīng)用的深入研究提供參考。

1 不同溶劑提取的化學(xué)成分

1.1 乙酸乙酯提取物

1.1.1 菲類化合物 LIU等[5]用95%的乙醇對杜鵑蘭假鱗莖進行提取，結(jié)果從其乙酸乙酯層分離到5種菲類化合物，1種為芐基取代菲：cremaphe-nanthrene L，4種為菲苷類：cremaphenanthrene M、cremaphenanthrene N、cremaphenanthrene O、cremaphenanthrene P。LIANG等[6]從杜鵑蘭95%乙醇提取的乙酸乙酯層中分離到5個菲類聚合物，分別為cremaphenanthrene A、cremaphenanthrene B、cremaphenanthrene C、cremaphenanthrene D和cremaphenanthrene E。LIU等[7-8]相繼從杜鵑蘭90%乙醇提取的乙酸乙酯層中分離到3個菲苷化合物，分別為7-羥基-4-甲氧基菲-2,8-二-O-β-D-葡萄糖苷、8-羥基-4-甲氧基菲-2,7-二-O-β-D-葡萄糖苷和2′,7′-二羥基-4,4′-二甲氧基-1,1′-聯(lián)菲-2,7-二-O-β-D-葡萄糖苷。李小平等[9]通過使用柱色譜法、液相色譜等分離方法結(jié)合波譜技術(shù)，從杜鵑蘭假鱗莖90%的乙醇提取物的乙酸乙酯層中鑒別出11個化合物，其中，2,2′,7,7′-四羥基-4,4′-二甲氧基菲-1,1′-二菲和7-羥基-2,4-二甲氧基菲為菲類化合物。

1.1.2 聯(lián)芐類化合物 原文珂等[10]使用色譜分離法，在杜鵑蘭90%乙醇提取物的乙酸乙酯層中鑒定出8個化合物，其中，shancigusim B和bulbocodin C為聯(lián)芐類化合物。袁橋玉等[11]也采用相似的色譜法，在杜鵑蘭乙酸乙酯層分離到10個化合物，其中，bulbocodin D為聯(lián)芐類化合物。

1.1.3 黃酮類化合物 劉量等[12]通過波譜數(shù)據(jù)和文獻對照方法，從杜鵑蘭假鱗莖95%乙醇提取物中分離得到 13個化合物，其中，乙酸乙酯層的芫花素、槲皮素和槲皮素3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷為黃酮類化合物，并首次分離得到。林松等[13]使用中低壓柱色譜、大孔樹脂柱色譜、高效液相柱色譜等方法，在杜鵑蘭55%乙醇提取液中分離出23個化合物，其中橙皮苷、補骨脂寧、新補骨脂異黃酮和異補骨脂查耳酮為黃酮類化合物。

1.1.4 丁二酸芐酯苷類 WANG等[14]使用核磁共振波譜從杜鵑蘭干燥假鱗莖的乙醇提取物的乙酸乙酯層中鑒別出4個丁二酸芐酯苷類，分別為1,4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖苷芐基)-(2R)-2-芐基葡萄酸酯、1-(4-β-D-吡喃葡萄糖芐基)-4-乙基-(2R)-2-異丁基蘋果酸酯、1-(4-β-D-吡喃葡萄糖芐基)-4-甲基-(2R)-2-苯基蘋果酸酯和(-)-(2R,3S)-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖苷芐基)-4-甲基-2-異丁基酒石酸酯。

1.1.5 其他類 除以上幾類成分外，乙酸乙酯層中提取到的物質(zhì)還含有生物堿類、脂肪族類、芳香類、氨基酸及其衍生物類等。劉量等[12]從杜鵑蘭乙酸乙酯層中提取出的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛和3-甲氧基-4-羥基苯乙醇為芳香類化合物。劉新橋等[15]用波譜技術(shù)鑒定出杜鵑蘭乙酸乙酯層中含有的4-羥基-2-甲氧基苯-1-O-β-D-吡喃葡萄糖為芳香類化合物。原文珂等[10]從杜鵑蘭90%乙醇提取物的乙酸乙酯層中鑒定出的間羥基苯甲酸、3-羥基苯丙酸和肉桂酸為芳香類化合物。

1.2 石油醚提取物

LIANG等[6]通過光譜數(shù)據(jù)與文獻對比，在杜鵑蘭95%乙醇提取物的石油醚層分離鑒定出2個菲類化合物，分別為2,7,2′-三羥基-4,4′,7′-三甲氧基-1,1′-聯(lián)菲和2,2′-二羥基-4,4′,7,7′-四甲氧基-1,1′-雙菲。劉量等[12]從杜鵑蘭假鱗莖95%乙醇提取物的石油醚層分離出1個蒽醌類化合物，為大黃素甲醚。

1.3 氯仿提取物

林冰等[16]在研究杜鵑蘭的脂溶性成分時，從杜鵑蘭85%乙醇提取液的氯仿層中鑒定到8個化合物，包括3個甾體類化合物：β-谷甾醇、豆甾醇和β-胡蘿卜苷；5個烷烴類化合物：二十九烷、三十烷-15-醇、三十烷醇、三十一烷十二醇和三十二烷醇。

1.4 水提取物

林冰等[17]通過將杜鵑蘭干燥假鱗莖的85%甲醇提取液和85%乙醇提取液混合，用柱色譜法進行分離，結(jié)果從杜鵑蘭水層分離出7個有機化合物，分別為蔗糖、三十二烷、正-三十四烷、三十六烷、十六烷酸、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯和酪氨酸。

1.5 正丁醇提取物

劉凈等[18]在研究杜鵑蘭的化學(xué)成分時，從杜鵑蘭75%乙醇提取液的正丁醇層分離到1個聯(lián)芐類化合物：5-甲氧基聯(lián)芐-3,3′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，2個丁二酸芐酯苷類化合物： loroglossin和militarine，1個酚苷類化合物：天麻苷。

2 藥理作用

2.1 抗腫瘤作用

LIU等[8]利用MTT法，將從杜鵑蘭中分離得到的雙菲苷類化合物進行細胞毒活性評價，結(jié)果表明，化合物2′,7-二羥基-4,4′-二甲氧基-1,1′-聯(lián)菲-2,7′-二-O-β-D-葡萄糖苷對癌細胞BT474(IC50為16.7 μmol/L)和SKBR3(IC50為12.6 μmol/L)有中等抑制作用。劉銀花等[19]發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭水提取物對小鼠癌細胞4T1有明顯的增殖抑制作用，且成劑量依賴關(guān)系。于林楠等[20]用MTT法對杜鵑蘭乙醇提取物作用于人結(jié)腸癌細胞HT29的抑制率進行評估發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭乙醇提取物對人結(jié)腸癌細胞HT29的凋亡有促進作用，大概與Cyt-C、Bax和Caspase-3的上調(diào)及Bcl-2 蛋白的下調(diào)有聯(lián)系。徐小娟等[21]在研究杜鵑蘭多糖對荷H22肝癌小鼠的影響時，通過制作小鼠H22肝癌模型，分析脾臟、胸腺指數(shù)對小鼠免疫器官的影響，檢測血清白介素-2、腫瘤壞死因子的含量，免疫組化法觀察Bcl-2的表達水平，結(jié)果表明：杜鵑蘭多糖可增強小鼠血清白介素-2和腫瘤壞死因子的活性，抗凋亡因子 Bcl-2的表達隨劑量的增加有所減少，且杜鵑蘭多糖高、中、低劑量的抑瘤率分別為 30.76%、37.57%和43.74%，表明杜鵑蘭多糖能增強小鼠對腫瘤的抑制能力。

2.2 抗血管生成作用

李余先等[22]分析了杜鵑蘭乙醇提取物對新生血管的影響，結(jié)果表明HUVEC的增殖活性和CAM血管新生成的作用受到杜鵑蘭乙醇提取物的抑制。homoisoflavanone為杜鵑蘭乙酸乙酯層中分離到的一種黃酮類化合物[23]，KIM等[24]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜新血管的形成受到抑制，主要與homoisoflavanone抑制HUVEC的生長及cdc2的低表達有關(guān)。此外，homoisoflavanone可使HUVEC的管腔和細胞遷移受到抑制作用，homoisoflavanone可以成為脈絡(luò)膜血管新生的抑制劑，并作為新的抗血管生成抑制素[25]。

2.3 抗炎、抗痛風(fēng)作用

HUR等[26]在研究杜鵑蘭乙醇提取物乙酸乙酯層分離得到的Cremastrine 抗炎作用時發(fā)現(xiàn)，HaCaT細胞中的活性氧在受到紫外線照射時會起抑制作用； Cremastrine會降低MAPK的激活水平，下調(diào)環(huán)氧化酶-2的表達，并減弱核轉(zhuǎn)錄因子-κB的核內(nèi)化，從而抑制白介素-6、白介素-8、腫瘤壞死因子的生成。由于杜鵑蘭的干燥假鱗莖中含有秋水仙堿，可使急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛在幾個小時內(nèi)得到有效緩解[27]。

2.4 抗菌作用

阮小麗等[28]將杜鵑蘭甲醇提取物進行抑菌試驗，結(jié)果表明，杜鵑蘭甲醇提取物對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和表皮葡萄球菌有抑菌作用，其MIC分別為0.063 g/mL、0.125 g/mL和0.063 g/mL。黃小容[29]的杜鵑蘭水層抑菌活性篩選試驗發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭水層的25%和75%的乙醇洗脫物可抑制金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。

2.5 M膽堿受體阻斷作用

HAHN等[30]對cremastrine進行全合成，同時對其M膽堿受體阻斷作用進行生物評價，結(jié)果表明cremastrine可以中等程度地抑制M1～M5 受體，其中cremastrine對M1和M5的作用最強，其IC50分別為2.8 μmo/L、10 μmo/L、10 μmo/L、10 μmo/L和4.0 μmo/L。由于杜鵑蘭中含有化合物cremastrine，所以杜鵑蘭也有M膽堿受體阻斷作用。IKEDA等[31]通過光譜、化學(xué)分析和活性跟蹤法，鑒別出杜鵑蘭中的cremastrine(1)抑制了氚標記的東莨菪堿和M3 受體的結(jié)合，且親和力為126 nmol/L。

2.6 降壓作用

日本制藥公司[31]在篩選毒蕈堿M3受體的過程中發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭70%乙醇提取物的乙酸乙酯層分離出的cremastosine I和cremastosine II可作為M受體結(jié)合的抑制劑，當M受體與其結(jié)合后，會產(chǎn)生一種副交感興奮作用，包括心臟活動的抑制，如：血壓降低和心率下降等。薛震等[32]研究杜鵑蘭化學(xué)成分時發(fā)現(xiàn)，犬靜脈注射15 μg/kg的杜鵑蘭素Ⅱ可以降低血壓39 mmHg，且持續(xù)30 min以上。

2.7 對造血系統(tǒng)的影響

黃越燕等[33]通過復(fù)制小鼠再障模型，然后給予杜鵑蘭復(fù)方制劑和生理鹽水(對照)，以各組檢測到的小鼠Hb、WBC、PLT、RET等指標為依據(jù)，分析杜鵑蘭復(fù)方制劑對小鼠再生障礙性貧血的影響，結(jié)果表明，給予杜鵑蘭的小鼠，其外周血細胞和骨髓造血功能均有增加現(xiàn)象，說明杜鵑蘭對造血系統(tǒng)有促進作用。

2.8 對酪氨酸激酶的激活作用

酪氨酸酶存在于正常人體的皮膚細胞內(nèi)，能將酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏兀斎梭w缺少酪氨酸酶時，人體就會表現(xiàn)出白化癥。為治療色素障礙性皮膚病，閆軍等[34]以酶促反應(yīng)速度為依據(jù)，探究21種中藥對酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果有13種藥對酪氨酸酶有上調(diào)激活作用(P<0.01)，杜鵑蘭為其中1種。

2.9 其他作用

劉穎等[35]在研究杜鵑蘭抗乳腺癌的作用機制時發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭還有抑制癌細胞遷移的作用；李小平分析杜鵑蘭化學(xué)成分時發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭具有降糖和解痙鎮(zhèn)痛等[36]作用。

3 質(zhì)量控制

杜鵑蘭的應(yīng)用品種從古代本草記載到現(xiàn)在的藥材市場一直都存在混亂現(xiàn)象，例如：名字混亂使用(金耳環(huán)和杜鵑蘭是不同品種的藥材，但金耳環(huán)沿用了杜鵑蘭的別名，造成經(jīng)營者分不清兩者區(qū)別而在市場上混亂銷售)[37]；一些偽品因與杜鵑蘭花色、形態(tài)、花期、功效區(qū)別甚微，造成混用等等[38]，因此，研究者們從性狀鑒別及理化鑒別等方面對杜鵑蘭進行鑒別，以保證杜鵑蘭的質(zhì)量。

3.1 性狀鑒別

杜鵑蘭的假鱗莖呈不規(guī)則的卵球狀，頂端有凹凸不齊的突起，基底部有不同形狀的須根痕，長1.8～3 cm，膨大部約1～2 cm。表面不平整，有皺縮，為黃棕或棕褐色，斷面為黃白或灰白色，有2～4個環(huán)帶，質(zhì)感較硬，帶黏性，難折斷，有淡淡的氣味，喜歡陰濕環(huán)境，常生長在海拔-2 900 m以下的溝邊陰濕地[39]。阮小麗等[40]使用顯微鏡對7種杜鵑蘭藥材進行鑒別發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭有2～3層黃色壁細胞，內(nèi)為薄壁細胞，含長約15～25μm的淀粉粒，近表皮的薄壁細胞有約15個長50～100 μm的草酸鈣針晶束，25～100 μm的網(wǎng)紋導(dǎo)管或螺紋，臍點大多呈點狀，淀粉多糊化，充滿整個細胞。

3.2 理化鑒別

3.2.1 一般化學(xué)反應(yīng)法 潘恒勤[41]分別用50%的乙醇浸泡杜鵑蘭和獨蒜蘭粉末數(shù)小時，然后加入3～4滴醋酸鉛溶液，結(jié)果裝杜鵑蘭樣品的試管未產(chǎn)生白色沉淀，而裝獨蒜蘭樣品的試管產(chǎn)生白色沉淀。繼續(xù)取2支干凈試管，在裝杜鵑蘭和獨蒜蘭粉末的試管中加入水，并水浴20 min，各取上清液與堿性酒石酸銅溶液反應(yīng)，結(jié)果2支試管都產(chǎn)生藍白色沉淀并有粘結(jié)塊，再將這2支試管水浴加熱，試管中的粘結(jié)塊都慢慢變成了磚紅色，但裝杜鵑蘭樣品的試管整個溶液都變成了磚紅色。

3.2.2 薄層色譜法 吳永林[42]在做杜鵑蘭和獨蒜蘭的薄層色譜時發(fā)現(xiàn)，使用不同的展開劑和顯色劑，2種樣品的現(xiàn)象不同。當以氯仿-甲醇為展開劑，以磷鉬酸-乙醇液為顯色劑時，在110°C下5～10 min就會顯色，Rf=0.7的地方，獨蒜蘭有1個紅色斑點產(chǎn)生，而杜鵑蘭在相應(yīng)位置沒有紅色斑點；當以正丁醇-丙酮-水為展開劑，苯胺-鄰苯二甲酸為顯色劑時，在110°下10～20 min就會顯色，在Rf=0.55的地方，杜鵑蘭和獨蒜蘭都有1個黃色斑點產(chǎn)生，但杜鵑蘭的斑點大于獨蒜蘭。

3.2.3 分子鑒別 DNA條形碼是一種通過與標準DNA片段進行對比來鑒定物種的技術(shù)，而rbcL基因序列又是DNA條形碼研究的一種候選片段，由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成，rbcL基因有較高的分辨率，在生物學(xué)上常被用作分子標記，因此可用來鑒別植物的真?zhèn)蝃43]。牛憲立等[44]通過對杜鵑蘭和偽品rbcL序列進行對比分析，結(jié)果顯示杜鵑蘭與秋花獨蒜蘭、陳氏獨蒜蘭和臺灣獨蒜蘭分別有5個、3個和4個突變點，即rbcL堿基存在明顯差異，可用來區(qū)分混品。

3.2.4 紫外吸收光譜 王玨等[45]使用紫外光譜對杜鵑蘭和其偽品山蘭進行生藥學(xué)鑒別，總結(jié)出杜鵑蘭正品的吸收峰在274 nm以上，而山蘭的吸收峰在273 nm以下，可供質(zhì)檢人員質(zhì)量鑒定。田昌海等[46]采用紫外吸收光譜法對不同產(chǎn)地的杜鵑蘭和獨蒜蘭多糖進行含量測定，結(jié)果表明，杜鵑蘭的含糖量一般比獨蒜蘭的含糖量低，且從數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，2008年的杜鵑蘭多糖比2007年的杜鵑蘭多糖含量高，猜測與樣品的干燥度和儲存時間有關(guān)。

3.2.5 高效液相色譜法 秋水仙堿是一種最初在百合科植物秋水仙中發(fā)現(xiàn)的生物堿，可以抑制細胞分裂，在臨床上常作為抗癌藥[47]和抗痛風(fēng)藥[48]使用，在農(nóng)業(yè)上常作為植物育種使用[49]，我國也有研究者從杜鵑蘭假鱗莖中提取出秋水仙堿[50]。袁理春等[51]采用HPLC法研究杜鵑蘭鱗莖不同部位秋水仙堿含量時發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭的地上部分基本沒有秋水仙堿，而鱗莖部位的秋水仙堿從內(nèi)向外呈遞增趨勢：外膜質(zhì)層的含量為0.134%，鱗莖外層的含量為0.171%。militarine和dactylorhin A為杜鵑蘭的丁二酸芐酯苷類主要成分，有延緩衰老及提高衰老動物的學(xué)習(xí)認知能力[52-54]，被作為一種分析杜鵑蘭質(zhì)量的指標成分。

4 小結(jié)與展望

杜鵑蘭作為我國傳統(tǒng)的中藥，藥用歷史悠久，有抗癌、降壓、抗菌等作用，在臨床上常作抗癌藥使用。目前對杜鵑蘭的化學(xué)成分、人工栽培、藥理作用等方面的報道漸多，對其發(fā)揮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、單體化合物抗癌作用機制和復(fù)方制劑的質(zhì)量標準等研究較少。因此，在今后的研究中，可對杜鵑蘭藥理活性進行跟蹤與篩選，系統(tǒng)研究其化學(xué)成分，確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；深入研究杜鵑蘭活性成分的作用機制和復(fù)方制劑質(zhì)量標準，對杜鵑蘭開發(fā)新藥和新劑型具有重要意義。另外，杜鵑蘭屬我國珍稀藥材，人們無節(jié)制的采摘導(dǎo)致資源匱乏，市場上出現(xiàn)命名和品種混亂使用的情況，嚴重影響其在臨床用藥的安全性，建議建立資源保護措施。