NGF和PTEN雙基因誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效果觀察

林平 陳毅 梁淑霞 李燾 邵依娜 趙有順 吳詠軍 涂迎春 黃志丹 安濤

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSC）能夠高度增殖分化，并且通過誘導(dǎo)向脂肪、骨、肌肉及神經(jīng)等多種組織細(xì)胞進(jìn)行分化[1-3]。既往研究已證實(shí)MSC通過基因修飾或適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑后，具有在特定基因表達(dá)和功能特性的神經(jīng)元細(xì)胞中分化的潛力[4-7]。此外，植入MSC對微環(huán)境信號有反應(yīng)并分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，這些神經(jīng)元樣細(xì)胞可誘導(dǎo)動物坐骨神經(jīng)再生[8-9]。MSC還具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力，有助于修復(fù)受損神經(jīng)元[10]。因此，MSC作為理想的種子細(xì)胞，為外周神經(jīng)細(xì)胞損傷的臨床治療提供了機(jī)會。然而，有研究表明MSC的神經(jīng)源性分化能力有限，移植入動物體內(nèi)后再生能力不足限制了MSC作為種子細(xì)胞在研究中的應(yīng)用。巢蛋白-1（Nestin-1）為神經(jīng)元的特征性標(biāo)志物。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的成員，對調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、存活及損傷神經(jīng)的再生修復(fù)具有重要作用和臨床意義。10號染色體上的磷酸酶和張力蛋白同源物丟失（phosphatase and tensin homologs deleted on chromosome 10，PTEN）已被證實(shí)在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，并且優(yōu)先在神經(jīng)元中表達(dá)[11]。PTEN基因的缺失或抑制能夠促進(jìn)軸突再生[12]。但迄今未見NGF過表達(dá)與PTEN瞬時下調(diào)相結(jié)合提升MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，從而影響對周圍神經(jīng)再生能力的相關(guān)研究。為進(jìn)一步證實(shí)NGF與PTEN雙基因修飾對MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響，從而影響對周圍神經(jīng)再生能力，筆者擬通過增強(qiáng)NGF過表達(dá)和PTEN瞬時下調(diào)對MSC進(jìn)行雙基因修飾，觀察雙基因修飾后的MSC向Nestin-1陽性細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞）分化的能力，為其提升周圍神經(jīng)再生能力提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 具有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的 Ori－CellTMSD 大鼠 MSC（MSC/GFP）（Cat.No.RASMX-01101）購自美國Cyagen Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠MSC的培養(yǎng) 復(fù)蘇SD大鼠來源的MSC/GFP，將其接種到含有OriCellTMMSC生長培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3d更換1次生長培養(yǎng)基。細(xì)胞長滿至80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%的EDTA）進(jìn)行消化，離心收集細(xì)胞后傳代，收集第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光情況。

1.2.2 大鼠MSC/GFP表面標(biāo)志物檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將第3代大鼠MSC/GFP使用胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每管1×106個/ml的細(xì)胞與細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44、CD45的一抗（美國eBioscience公司）混合，然后再與異硫氰酸熒光素（FITC，美國BD公司）偶聯(lián)的二抗混合，4℃避光孵育30min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.3 MSC/GFP的成骨和脂肪形成分化能力檢測 將大鼠MSC/GFP用胰蛋白酶消化并接種于成骨分化培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、50mg/L抗壞血酸、0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸鹽的DMEM培養(yǎng)基）和脂肪形成分化培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10mg/L胰島素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、0.2mmol/L羅格列酮的 DMEM 培養(yǎng)基），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3d更換1次分化培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)后第19天，使用茜素紅S染色和油紅O染色鑒定成骨分化和脂肪形成分化。

1.2.4 重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 設(shè)計(jì)特異性引物（NGF-Xbal-F：3′-CTAGTCTAGAGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC-5′，NGF-BamHIR：3′-TCAGGATCCGCCTCTTCTTGCAGCCTTCCTG-5′），使用Takara PrimerSTAR Max DNA聚合酶從大鼠cDNA中PCR擴(kuò)增含有XbaI和BamHI核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的NGF序列。構(gòu)建重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF，測序分析重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF。使用LipoHigh將重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF轉(zhuǎn)染到大鼠MSC/GFP中，轉(zhuǎn)染后 24h，加入最佳篩選濃度（500μg/ml）的遺傳霉素（G418），每隔2d更換新的含有最佳篩選濃度G418的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)4周。收集抗性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，命名為大鼠NGFhighMSC/GFP。

1.2.5 小干擾RNA（siRNA）干擾瞬時下調(diào)大鼠NGFhighMSC/GFP中PTEN的表達(dá) 設(shè)計(jì)PTEN siRNA干擾序列：有義：5′-GAGGCGCUAUGUAUAUUAUdTdT-3′，反義：5′-AUAAUAUACAUAGCGCCUCdTdG-3′。取對數(shù)生長期的第3代細(xì)胞接種于24孔板，至細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合。siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，5h后更換含有10%胎牛血清且不含抗生素的DMEM，培養(yǎng)48h。通過實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）分別測定PTEN mRNA和蛋白相對表達(dá)量。siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組為雙基因修飾的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP，對照組為未經(jīng)基因修飾的大鼠MSC/GFP。

1.2.7 NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA相對表達(dá)量檢測 使用Trizol試劑從各組細(xì)胞中提取總RNA，吸光度（OD）260/OD280在1.8～2.0內(nèi)提示樣品RNA滿足實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)說明書，使用BioRT cDNA Strand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用2×Taq PCR Master Mix進(jìn)行，進(jìn)行qRT-PCR分析。用于擴(kuò)增NGF、PTEN、Nestin-1和內(nèi)參GAPDH的特異性引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 NGF、PTEN和Nestin-1蛋白相對表達(dá)量檢測 裂解提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度，等量總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1h，分別加入 NGF、PTEN和 Nestin-1一抗（英國Abcam公司），4℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液，室溫孵育1～2h。TBST漂洗，然后使用蛋白質(zhì)印跡ECL熒光檢測試劑進(jìn)行觀察。

1.2.9 NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP的細(xì)胞活力測定采用細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（CCK-8）。將兩組細(xì)胞以2 000個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24、48和72h進(jìn)行取樣檢測，加入10μl CCK-8后，將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)4h，用微量滴定板讀數(shù)儀分析450nm處的光密度。進(jìn)行了5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.10 氧-葡萄糖剝奪實(shí)驗(yàn) 通過檢測氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，分析雙基因遺傳誘導(dǎo)對大鼠MSC/GFP存活的影響。將兩組細(xì)胞接種于無血清和無葡萄糖的人工腦脊液（ACSF）（pH 7.4），其中含有 125mmol/L氯化鈉，5mmol/L氯化鉀，25.7mmol/L碳酸氫鈉，2mmol/L硫酸鎂，1.2mmol/L磷酸二氫鈉和10mmol/L蔗糖。細(xì)胞在 37℃，90%N2，9%CO2和 1%O2環(huán)境下孵育。4h 后，用生長培養(yǎng)基替換ACSF，將細(xì)胞在正常氧條件下37℃培養(yǎng)2h，收集細(xì)胞懸液。根據(jù)Annexin V凋亡試劑盒的說明，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSC/GFP綠色熒光和表面標(biāo)志物表達(dá)情況檢測 雙基因未修飾前，對OriCellTM大鼠MSC/GFP的綠色熒光表達(dá)情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)次代培養(yǎng)時，顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光。約90%的第3代細(xì)胞仍可見熒光信號，見圖1（插頁）。使用表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44、CD45抗體對第3代大鼠MSC/GFP進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，通過明確確定的細(xì)胞表面抗原表達(dá)來分析大鼠MSC/GFP的規(guī)格和純度。結(jié)果顯示（99.29±3.12）%的細(xì)胞 CD44陽性，（96.41±2.33）%的細(xì)胞 CD29 陽性，（8.91±0.66）%的細(xì)胞 CD34陽性，（6.79±1.01）%的細(xì)胞CD45陽性，見圖2（插頁）。

2.2 大鼠MSC/GFP的成骨和脂肪形成分化能力檢測將大鼠MSC/GFP在成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)19d后（圖3a，插頁），在顯微鏡下觀察到紅色礦化結(jié)節(jié)（圖3b，插頁）。此外，脂肪形成分化培養(yǎng)基中生長的大鼠MSC/GFP不斷擴(kuò)大，可見細(xì)胞內(nèi)脂滴（圖3c，插頁）。顯微鏡下見油紅O染色呈陽性反應(yīng)（圖3d，插頁）。

2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF 凝膠電泳顯示在成功從大鼠cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)生約0.72kb的目的片段NGF（圖4a）。XbaI和BamHI酶切鑒定重組質(zhì)粒，顯示出5.4和0.72kb兩個片段（圖4b）。對重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF進(jìn)行測序，單點(diǎn)突變發(fā)生在186（TC）（圖4c），在大鼠NGF的氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)突變（圖4d）。因此，上述數(shù)據(jù)表明成功構(gòu)建了攜帶大鼠NGF片段的重組質(zhì)粒。

2.4 兩組細(xì)胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠MSC/GFP中NGF和Nestin-1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，而PTEN mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

2.5 雙基因修飾調(diào)控對大鼠MSC/GFP細(xì)胞活力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠MSC/GFP在48、72h時間點(diǎn)的OD值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)果表明雙基因修飾可以促進(jìn)大鼠MSC/GFP的增殖（圖6）。

2.6 雙基因修飾調(diào)控對大鼠MSC/GFP氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的增殖和凋亡的影響 對照組和實(shí)驗(yàn)組在正常缺氧條件下存活率相當(dāng)，細(xì)胞存活率分別為93.92%和95.21%。氧-葡萄糖剝奪處理后，實(shí)驗(yàn)組存活率為65.03%，明顯高于對照組的51.77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。表明雙基因修飾可以促進(jìn)大鼠MSC/GFP的存活。

圖4 重組載體pEF1ANeo01-NGF的鑒定（a：擴(kuò)增產(chǎn)生約0.72kb的 DNA 片段，M：DL 2000 DNA 標(biāo)記，1～5：陽性克??；b：重組載體pEF1ANeo01-NGF用內(nèi)切核酸酶XbaI和BamHI消化，顯示出5.4和 0.72kb 片段，M：1kb DNA Ladder，1～2：通過雙核酸內(nèi)切酶消化的產(chǎn)物；c：DNA測序顯示186（T-C）處的單突變；d：編碼的氨基酸序列與大鼠NGF精確匹配）

3 討論

MSC是指骨髓基質(zhì)內(nèi)非造血干細(xì)胞來源的細(xì)胞亞群，具有自我更新、多向分化潛能、對機(jī)體損傷小、易得性強(qiáng)、高增殖特性、易于基因操作等優(yōu)點(diǎn)，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究應(yīng)用最為廣泛的成體干細(xì)胞[13]。MSC可能作用機(jī)制包括：MSC向損傷組織遷移和抑制宿主免疫反應(yīng)的能力；MSC的去分化和再分化；MSC直接分化為上皮細(xì)胞或消化道干細(xì)胞；MSC與消化道干細(xì)胞或成熟上皮細(xì)胞融合；MSC參與損傷微環(huán)境的重建[14]。此外，MSC雖表現(xiàn)出了神經(jīng)再生的能力，但其有效性仍有待提高。

本研究在培養(yǎng)過程中對MSC/GFP的熒光信號持續(xù)進(jìn)行檢測，并對OriCellTMSD大鼠MSC/GFP的質(zhì)量進(jìn)行評價。通過檢測 MSC/GFP中 CD29、CD44、CD34、CD45 等多種抗原標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MSC/GFP CD29和CD44表達(dá)呈陽性，但只有少數(shù)細(xì)胞CD34和CD45表達(dá)呈陽性，大鼠MSC/GFP特異性抗原標(biāo)志物的表達(dá)模式與MSC的既定表型是一致的[15]，由此鑒定了MSC/GFP的純度。本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠MSC/GFP能夠在成骨和成脂分化培養(yǎng)基中生長，并對茜素紅S和油紅O呈陽性染色，表明大鼠MSC/GFP具有多能分化能力。因此，筆者認(rèn)為OriCellTM大鼠MSC/GFP具有高效的特異性和多潛能，可為將來進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

圖5 兩組細(xì)胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較（a：兩組細(xì)胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA相對表達(dá)量比較；b：兩組細(xì)胞NGF、PTEN和Nestin-1蛋白相對表達(dá)的電泳圖；c：兩組細(xì)胞NGF蛋白相對表達(dá)量比較；d：兩組細(xì)胞PTEN蛋白相對表達(dá)量比較；e：兩組細(xì)胞Nestin-1蛋白相對表達(dá)量比較）

圖6 CCK-8測定細(xì)胞增殖

圖7 由大鼠MSC/GFP和NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP的氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（a：在生長培養(yǎng)基和常規(guī)條件下培養(yǎng)的大鼠MSC/GFP；b：在生長培養(yǎng)基和常規(guī)條件下培養(yǎng)的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP；c：用氧-葡萄糖剝奪處理的大鼠MSC/GFP；d：用氧-葡萄糖剝奪處理的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP）

NGF具有增強(qiáng)周圍神經(jīng)損傷愈合的能力，并且通過產(chǎn)生神經(jīng)肽信號和受體促進(jìn)MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[16-17]。而PTEN是一種細(xì)胞內(nèi)固有表達(dá)的非分泌型蛋白，能夠通過PTEN/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號傳導(dǎo)通路完成細(xì)胞突起的生長，其表達(dá)受抑制有利于損傷的周圍神經(jīng)的再生。因此，本研究初步探索了大鼠MSC/GFP中NGF和PTEN的固有表達(dá)，結(jié)果顯示大鼠MSC/GFP呈現(xiàn)NGF低表達(dá)以及PTEN高表達(dá)，該結(jié)果與之前的研究一致：在SD大鼠MSC中幾乎沒有檢測到NGF的表達(dá)[18]，而PTEN在人MSC中有表達(dá)[19]。多項(xiàng)研究表明，PTEN能夠下調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/mTOR促存活信號[20-21]，而PI3K/Akt信號通路的激活被證明是NGF促進(jìn)MSC增殖的關(guān)鍵[22]。此外，Akt在介導(dǎo)NGF在MSC向神經(jīng)元分化和抗神經(jīng)元凋亡中具有一定的作用[23-24]。目前，Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)MSC在NGF培養(yǎng)基中能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其原因在于MSC能夠觸發(fā)NGF-PI3K/Akt/mTOR信號通路。因此，大鼠MSC/GFP固有的較強(qiáng)PTEN可以通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路和抑制NGF的作用來減弱受損外周神經(jīng)的再生。

為了增強(qiáng)大鼠MSC/GFP修復(fù)受損外周神經(jīng)的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染含有大鼠NGF片段的重組質(zhì)粒對NGF進(jìn)行過表達(dá)，同時采用特異性小RNA干擾瞬時下調(diào)PTEN，但PTEN并沒有永久性的敲除。PTEN作為一個主要的腫瘤抑制因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心、肝、腎、胃腸道及皮膚等全身多器官均有表達(dá)，既往研究也顯示PTEN的藥理學(xué)抑制可能是一種抗癌治療方法[13，26]。筆者發(fā)現(xiàn)siRNA干擾可瞬時下調(diào)MSC/GFP中PTEN的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEF1ANeo01-NGF可使NGF的表達(dá)上調(diào)。此外，本研究還揭示了雙基因修飾對大鼠MSC增殖的積極作用。為了評估雙基因修飾對生物學(xué)行為的影響，還檢測了氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，雙基因修飾促進(jìn)細(xì)胞存活，有利于再生的應(yīng)用。上述信號傳導(dǎo)途徑也能夠調(diào)控雙基因修飾對在氧-葡萄糖剝奪條件下培養(yǎng)的MSC的增殖和存活。

為了探索雙基因修飾能否增強(qiáng)大鼠MSC的神經(jīng)元分化，本研究對是否進(jìn)行雙基因修飾細(xì)胞中的神經(jīng)元分化標(biāo)志物Nestin-1表達(dá)進(jìn)行了評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠MSC/GFP的Nestin-1表達(dá)較弱，這與之前的報(bào)道一致[27-28]，但雙基因修飾在mRNA和蛋白水平上Nestin-1表達(dá)卻顯著上調(diào)。上述發(fā)現(xiàn)表明大鼠NGFhigh/PTENlowMSC/GFP更傾向于神經(jīng)元細(xì)胞分化，其原因可能為高表達(dá)的NGF抑制了PTEN介導(dǎo)的信號通路。

綜上所述，大鼠骨髓來源的MSC/GFP在機(jī)體固有地低表達(dá)NGF并高表達(dá)PTEN。通過NGF的過表達(dá)和PTEN的瞬時下調(diào)進(jìn)行雙基因修飾能夠使大鼠骨髓來源的MSC獲得較強(qiáng)的分化為Nestin-1陽性細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞）的能力，由此表明雙基因的修飾增強(qiáng)了MSC的神經(jīng)再生能力，但具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探討。