納米白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備及分配系數(shù)測(cè)定

張茹，元琳琳，孫凱玥，王珊，耿麗娜,＊，張建軍

1河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 石家莊 050024

2河北師范大學(xué)分析測(cè)試中心, 石家莊 050024

1 引言

白藜蘆醇(3,4’,5-三羥基-1,2二苯乙烯)是一種天然存在的多酚和植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、漿果、花生等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗癌和神經(jīng)保護(hù)等作用1,2。Mohamed等3綜述了白藜蘆醇在直腸癌和皮膚癌預(yù)防和治療中的作用。Jang等4報(bào)道了白藜蘆醇的抗白血病特性，并對(duì)其生物學(xué)和藥理活性進(jìn)行了大量的研究5。然而，白藜蘆醇難以通過高選擇性的血腦屏障(blood brain barrier,BBB)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的生物效率不太理想，腦內(nèi)生物利用度低6。

脂質(zhì)體作為近幾年新出現(xiàn)的一種藥物載體，無毒、無免疫原，主要由磷脂雙層膜組成，具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，雙層膜中含有親水分子和親脂分子7，具有靶向性、低毒性、生物相容性和長(zhǎng)效緩釋性等諸多優(yōu)點(diǎn)8。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂質(zhì)體包封，可改善藥物的理化性質(zhì)，提高其穩(wěn)定性和生物利用度9。Kristl等10研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇脂質(zhì)體能夠延緩藥物釋放，細(xì)胞吸收明顯增強(qiáng)，并能有效避免自由基的損傷。Ethemoglu等11研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體包封可以改善癲癇大鼠腦內(nèi)游離白藜蘆醇的作用，使白藜蘆醇的抗氧化和抗癲癇特性有所提高。王宏雁等12采用逆向蒸發(fā)法制備了白藜蘆醇納米脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力良好并且對(duì)DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)具有明顯的清除作用。王彥春等13發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇脂質(zhì)體比其純藥溶劑對(duì)帕金森模型大鼠黑質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)。

一般來說，藥物從脂質(zhì)體釋放取決于動(dòng)力學(xué)因素，如藥物滲透性和熱力學(xué)參數(shù)。脂質(zhì)體研究過程中，經(jīng)常使用油-水(正辛醇-水)分配系數(shù)(Po/w)來預(yù)測(cè)藥物的包封率以及載藥量14。鄧英杰等15以正辛醇-水分配系數(shù)來模擬物質(zhì)在體內(nèi)水相和生物相的分配情況，預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收情況。這種方法以研究藥物的親脂性為主16，反映藥物的疏水作用而忽略生物膜的生物學(xué)特性17。而脂質(zhì)體-水分配系數(shù)(Plip/w)能模擬生物膜的結(jié)構(gòu)18，預(yù)測(cè)藥物在生物膜中的的分配情況，反映在體內(nèi)藥物與生物膜(磷脂雙分子層)間的作用情況，如疏水性、靜電力和氫鍵等藥物與生物膜之間的綜合作用19。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究中也同樣使用脂質(zhì)體-水分配系數(shù)來表征藥物在生物膜中的分配情況20。Chavez-Capilla等21利用脂質(zhì)體-水分配系數(shù)判斷砷類化合物通過細(xì)胞膜的能力，更加精準(zhǔn)地評(píng)估了三價(jià)砷和硫砷化物對(duì)人體的危害。Esteves等22將脂質(zhì)體-水分配系數(shù)作為預(yù)測(cè)人體藥物吸收的生物模型。Ikonen等23建立了測(cè)定脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的電化學(xué)方法，可更加精準(zhǔn)地測(cè)定樣品中磷的含量。油-水分配系數(shù)和脂質(zhì)體-水分配系數(shù)不僅可單獨(dú)用于測(cè)定藥物在生物膜的分配情況，一些學(xué)者在研究中采用兩者結(jié)合的方法綜合了判斷了藥物于生物膜之間的作用情況。陸偉根等24測(cè)定了Po/w和Plip/w隨體系pH值的變化情況，發(fā)現(xiàn)兩者均隨體系pH的增加而增大，初步判斷草烏甲素與磷脂膜之間以疏水作用為主。鐘海軍等25通過對(duì)比燈盞花素Po/w和Plip/w隨體系pH的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)兩者正好相反，表明藥物與磷脂膜之間的作用力以氫鍵、靜電力等為主，而疏水作用為輔。

我們的前期工作已經(jīng)測(cè)定了檸檬酸鐵脂質(zhì)體(FAC-Lip)和血紅素鐵脂質(zhì)體(Heme-Lip)的脂質(zhì)體-水分配系數(shù)、藥物與脂質(zhì)體膜層之間的作用力類型及吉布斯自由能26。在此基礎(chǔ)上，我們制備了納米白藜蘆醇脂質(zhì)體(RES-Lip)，測(cè)定RES-Lip的Po/w和Plip/w，觀察藥物在生物膜表面分配情況并分析藥物與脂質(zhì)體膜的作用力類型及吉布斯自由能。研究結(jié)果可指導(dǎo)納米脂質(zhì)體的合成，預(yù)測(cè)藥物的體外釋放及體內(nèi)吸收，并為在體實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與主要儀器

白藜蘆醇(純度 ＞ 98%)，上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂(PC，純度 ＞ 75%)，北京源華美磷脂科技有限公司；膽固醇(chol，純度 ＞ 95%)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，生物科技發(fā)展有限公司。RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；CPS2超聲波粉碎機(jī)，寧波新芝超聲有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；TGL-18-B高速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；U-3010紫外-可見分光光度計(jì)，日本日立公司；JEM100SX透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立公司。

2.2 RES-Lip的制備

采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)-超聲法制備納米白藜蘆醇脂質(zhì)體(RES-Lip)混懸液。按照一定膜材比：卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比(mPC:mChol= 5 : 1，8 : 1，10 :1，12 : 1)、藥脂比(RES與卵磷脂質(zhì)量比：mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)準(zhǔn)確稱量，加入適量無水乙醇將其溶解，待其完全溶解后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，置于45 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至乙醇完全揮發(fā)并形成均勻透明的薄膜。量取磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH = 7.4) 10 mL，倒入上述圓底燒瓶中進(jìn)行水化洗膜，即可得到RES-Lip混懸液。水浴超聲處理，再將混懸液至于透析袋中，避光透析，除去未包封的RES，所得產(chǎn)物RES-Lip密封保存于4 °C的冰箱中備用。

2.3 RES-Lip的形貌及粒徑分布

用移液槍吸取1滴已稀釋的新制備的RES-Lip混懸液，滴在鍍膜的銅網(wǎng)表面，自然晾干，再用4%磷鎢酸溶液對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行負(fù)染30 s，最后將晾干的銅網(wǎng)放在透射電鏡下觀察RES-Lip微觀形貌。

用二次水將RES-Lip稀釋10倍，超聲后使用激光粒度儀測(cè)粒徑。

2.4 RES-Lip包封率的測(cè)定

首先配制一系濃度梯度的RES標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)在其最大吸收波長(zhǎng)306 nm處的吸光度，繪制成吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC=1 : 40)透析液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在306 nm處的吸光光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相應(yīng)的RES含量。按(1)計(jì)算RES-Lip的包封率(EE%)。

2.5 RES-Lip平衡時(shí)間的測(cè)定

對(duì)2.2節(jié)中制備的RES-Lip進(jìn)行平衡透析，測(cè)定不同時(shí)間t下透析液中RES的濃度，得到平衡曲線，確定平衡時(shí)間。

2.6 RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的測(cè)定

按文獻(xiàn)26的方法，取適量的RES-Lip放入透析袋，采用平衡透析法，室溫測(cè)定透析液中RES的濃度，按公式(2)求算lgPlip/w值。

其中Vl為 RES-Lip的體積(L)，C1是RES-Lip包封的質(zhì)量濃度(g·L?1)，C2是透析液中RES的質(zhì)量濃度(g·L?1)，VL是脂質(zhì)體磷脂雙分子層的體積(L)，此值按文獻(xiàn)27計(jì)算，lgPlip/w為RES的脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值。

2.6.1 膜材比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

按2.2節(jié)的方法制備不同膜材比(mPC:mChol=5 : 1，8 : 1，10 : 1，12 : 1)的RES-Lip，按上述方法分別求算其對(duì)應(yīng)的lgPlip/w?？疾炷げ谋葘?duì)RESLip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響。

2.6.2 藥脂比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

按2.2節(jié)的方法制備不同藥脂比(mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)的RES-Lip，按上述方法分別求算其對(duì)應(yīng)的lgPlip/w?？疾焖幹葘?duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響。

2.6.3 pH值對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

等體積量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-Lip放入透析袋中，按上述方法分別求算其對(duì)應(yīng)的lgPlip/w。

2.7 RES-Lip油-水分配系數(shù)的測(cè)定

將文獻(xiàn)24中的測(cè)定方法略加改動(dòng)，等體積量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-PBS緩沖溶液和相應(yīng)pH的正辛醇在小燒杯中混合，磁力攪拌2 h，室溫放置30 min，取下層水相離心15 min (離心力2000g)。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定分配前后水相中RES的濃度，二者之差即為RES在正辛醇相中的濃度。按公式(3)計(jì)算lgPo/w值。

圖1 RES-Lip的透射電鏡圖(a)和粒徑分布(b)Fig. 1 TEM images (a) and size distribution (b) of RES-Lip.

其中Co和Cw分別代表RES分配在油水兩相中的質(zhì)量濃度，lgPo/w即為油-水分配系數(shù)對(duì)數(shù)值。

2.8 RES與脂質(zhì)體膜層之間吉布斯自由能的測(cè)定

按文獻(xiàn)26,28記載的方法，在25 °C條件下，檢測(cè)透析平衡時(shí)脂質(zhì)體中藥物濃度和透析液中的藥物濃度，按公式(4)、(5)計(jì)算藥物與脂質(zhì)體磷脂雙分子層之間的吉布斯自由能(ΔG)：

其中Kapp是表觀常數(shù)，Xb是平衡時(shí)脂質(zhì)體中藥物濃度(mg·mL?1)，Pf是平衡時(shí)透析液中的藥物濃度(mg·mL?1)，z是藥物所帶的電荷(C)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)(C·mol?1)，Ψ是脂質(zhì)體zeta電位(mV)。

3 結(jié)果與討論

3.1 RES-Lip的形貌及粒徑分布

圖1a為RES-Lip的透射電鏡圖，從圖中可以看出，脂質(zhì)體為球形囊泡，分散較為均勻，并且脂質(zhì)體的粒徑大部分在100 nm以下。研究表明，與粒徑為1-100 μm的普通脂質(zhì)體相比，小粒徑(＜ 200 nm)的脂質(zhì)體在穿透性能和體內(nèi)被動(dòng)靶向性等方面具有更大的優(yōu)勢(shì)29。

圖1b為RES-Lip的粒徑分布圖，由圖可知，RES-Lip的粒徑為100 nm左右，與圖1a結(jié)果一致。

3.2 RES-Lip的工作曲線和包封率

用紫外分光光度計(jì)測(cè)在其最大吸收波長(zhǎng)306 nm處的吸光度，繪制成濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，由圖2看出RES 的工作曲線方程為A=0.1192C? 0.01171，R2= 0.9994即在0.1500-15.0000 μg·mL?1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，根據(jù)公式(1)就算出RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC= 1:40)的包封率為90.72 ± 1.24。

3.3 RES-Lip的平衡時(shí)間

圖2 RES-Lip的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of RES-Lip.

圖3 RES在脂質(zhì)體-水相中平衡分配時(shí)間Fig. 3 Equilibrium partition time of RES in the phases of liposome and water.

測(cè)定不同時(shí)間時(shí)透析液中RES的濃度，得到RES-Lip在脂質(zhì)體-水相中平衡曲線如圖3所示，開始時(shí)RES濃度波動(dòng)較大，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，4 h后RES濃度波動(dòng)逐漸減小，呈基本穩(wěn)定的狀態(tài)，因此認(rèn)為當(dāng)t≥ 4 h時(shí)，RES-Lip在脂質(zhì)體-水相中達(dá)到平衡。

3.4 RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的測(cè)定

3.4.1 膜材比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

圖4為膜材比不同時(shí)RES-Lip的lgPlip/w，從圖中可以看出，隨著膜材比的增加lgPlip/w值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，這是由于加入適量的膽固醇提高了RES-Lip的穩(wěn)定性，減少藥物的泄露；但膽固醇的含量過高，會(huì)使脂膜剛性增加，排列緊密30,31，藥物難以進(jìn)入脂質(zhì)體磷脂雙分子層中，因此lgPlip/w會(huì)減小。從圖上可以看出，當(dāng)膜材比分別為10 : 1，RES-Lip的lgPlip/w最大，說明此時(shí)藥物與磷脂膜之間的作用力也最大。

3.4.2 藥脂比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

圖5為藥脂比不同時(shí)RES-Lip的脂質(zhì)體-水分配系數(shù)lgPlip/w。從圖中可以看出，隨著藥脂比的增加lgPlip/w呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)。這是因?yàn)樵谄渌麠l件固定的情況下，隨著藥物的增加，可以進(jìn)入脂質(zhì)體雙分子層的藥物也隨之增加了；當(dāng)藥物量達(dá)到一定時(shí)，脂質(zhì)膜層的包封量達(dá)到最大，藥物不能繼續(xù)分配進(jìn)入脂質(zhì)體膜層中。藥脂比為1 : 40時(shí)，lgPlip/w最大，說明此時(shí)藥物與磷脂膜間的作用力最大。

3.4.3 pH對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響

圖6a為RES-Lip在不同pH緩沖溶液中的脂質(zhì)體-水分配系數(shù)lgPlip/w，從圖中可以看出，lgPlip/w隨體系pH的增加而減小，即RES在脂質(zhì)體中的分配減小，當(dāng)體系的pH在5-7.5之間時(shí)lgPlip/w變化比較緩慢，說明這個(gè)范圍有利于制備RES-Lip。Plip/w反映的是多種力的綜合作用，包括疏水作用、氫鍵、靜電作用等。為了能更加準(zhǔn)確的判斷RES與磷脂膜之間的作用力類型，我們還測(cè)定了RES的油-水分配系數(shù)。

圖4 膜材比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響Fig. 4 Effect of membrane material ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

圖5 藥脂比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響Fig. 5 Effect of lipid to drug ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

圖6 RES-Lip的脂質(zhì)體-水分配系數(shù)lgPlip/w (a)和油-水分配系數(shù)lgPo/w(b)隨pH的變化趨勢(shì)Fig. 6 The trend of liposome/water coefficients lgPlip/w(a) and the n-octanol/water coefficients lgPo/w (b) of RES-Lip with pH.

3.5 RES油水分配系數(shù)的測(cè)定

圖6b為RES的油-水分配系數(shù)隨lgPo/w隨pH的變化趨勢(shì)，由圖可知，RES的lgPo/w隨pH的增加而減小，即lgPo/w和lgPlip/w變化趨勢(shì)相同，由于lgPo/w主要反映的是疏水-疏水相互作用，與文獻(xiàn)24結(jié)果一致，所以可以說明RES與磷脂雙分子層的作用力以疏水作用為主，而氫鍵和靜電作用等其他作用為輔。

表1 透析平衡時(shí)RES-Lip的相關(guān)參數(shù)及ΔGTable 1 The parameters and ΔG of RES-Lip at dialysis equilibrium.

3.6 RES與脂質(zhì)體膜層之間吉布斯自由能的測(cè)定

由圖3可知，平衡透析4 h時(shí)，RES在脂質(zhì)體-水相中達(dá)到平衡，此時(shí)RES-Lip的相關(guān)參數(shù)Xb、Pf、T、Ψ見表1，將其帶入公式(4)、(5)中可得RES-Lip中藥物與脂質(zhì)體膜之間的吉布斯自由能(ΔG)為?17.07 kJ·mol?1。與我們前期所測(cè)定的FAC-Lip和Heme-Lip中藥物與脂質(zhì)體膜的吉布斯自由能(?12.7 kJ·mol?1和?18.2 kJ·mol?1)結(jié)果類似26。Russell28和全東琴32等研究表明，藥物與磷脂雙層膜之間吉布斯自由能的大小能反映藥物與膜之間結(jié)合的難易程度，ΔG越小，體系越穩(wěn)定，藥物與磷脂膜越容易結(jié)合。因此，表明在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，RESLip的制備比較容易。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法-超聲法成功制備了納米白藜蘆醇脂質(zhì)體(RES-Lip)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征，探究了體系pH值、膜材比和藥脂比對(duì)RES-Lip脂質(zhì)體-水分配系數(shù)的影響、藥物與脂質(zhì)體膜之間的作用力類型和吉布斯自由能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著膜材比和藥脂比例的增加，lgPlip/w均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；而隨著pH的增加lgPo/w和lgPlip/w均呈減小趨勢(shì)，說明RES與磷脂膜之間的作用力以疏水作用為主。并且當(dāng)膜材比為10 : 1，藥脂比為1 : 40時(shí)，lgPlip/w最大，說明此時(shí)RES與磷脂膜間的疏水作用力最大。通過計(jì)算得到RES-Lip中RES與磷脂膜之間的吉布斯自由能為?17.07 kJ·mol?1，這表明RES容易包封到脂質(zhì)體中。本實(shí)驗(yàn)可為載藥脂質(zhì)體的制備、體外釋放及藥物在生物體的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考。