加州鱸源普通變形桿菌分離、鑒定及藥敏分析

柯文杰，孫斌斌，覃華斌，袁富豪，盤賜光，楊映，于輝，陳言峰

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528231；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；3.珠海容川飼料有限公司，廣東 珠海 519100）

加州鱸Micropterus salmoides 又名大口黑鱸，原產(chǎn)北美洲的江河、湖泊中，生長(zhǎng)快、肉味鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，已在許多國家和地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[1,2]。但是，隨著養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加州鱸養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，細(xì)菌性病害日益增多[3]。

普通變形桿菌Proteus vulgaris 是一種重要的條件致病菌，通常存在于爬行動(dòng)物、鳥類、哺乳動(dòng)物等的腸道中，可導(dǎo)致胃腸炎、腦膜炎、敗血癥等疾病，還會(huì)污染肉類和蛋類等食品,引起食物中毒、尿路感染和傷口感染[4-6]，對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有潛在的危害。研究發(fā)現(xiàn)：普通變形桿菌能感染中華鱉Trionyx sinensis[6]、蛇[7]、大口鲇Silurus meridionalis－Chen[8]、豬[9]、鱷Crocodylus siamensis[10]和斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus[11]等諸多動(dòng)物，但該菌感染加州鱸還未見報(bào)道。本研究通過對(duì)從患病加州鱸體內(nèi)分離到的普通變形桿菌進(jìn)行鑒定、人工感染及藥物敏感性試驗(yàn)，以期為該病原引發(fā)的水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病死亡的加州鱸取自廣東佛山市某養(yǎng)殖場(chǎng)，主要癥狀為體表有潰瘍病灶，肝、腎臟輕度充血，腸道潰爛，健康的加州鱸（平均體質(zhì)量114g）購于佛山某養(yǎng)殖場(chǎng)。

普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯、腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定盒均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。藥敏紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

按無菌操作步驟，從病魚的肝、腎分離病原菌，在普通營養(yǎng)瓊脂上劃線，37℃培養(yǎng)48h，挑取2 株優(yōu)勢(shì)菌落（201901141 和201901142）進(jìn)行純化培養(yǎng)，分別接種到營養(yǎng)肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)18h，純化后的細(xì)菌加入無菌甘油，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生理生化試驗(yàn)

將菌株201901141 和201901142 的新鮮菌液分別接種于生化管，按說明書對(duì)葡萄糖（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）、乳糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、纖維二糖、山梨醇、衛(wèi)茅醇、肌醇、甘露醇、水楊素、七葉苷、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR）、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP）、西蒙氏檸檬酸鹽、硫化氫、尿素、半固體瓊脂（動(dòng)力）、β-半乳糖苷、硝酸鹽還原進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 16S rRNA 基因的擴(kuò)增與序列分析

選用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物（正向：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向：5’-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50μL 的PCR 反應(yīng)體系中含有：5μL 10×PCR 緩沖液（含Mg2+），4μL 10mmol/L 4×dNTP，各1μL 10mmol/L 正向和反向引物,1μL Taq DNA 聚合酶（1U/μL），1μL 模板，37μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,送至生工生物工程（上海）股份有限公司廣州測(cè)序部純化后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的核酸序列進(jìn)行BLAST 分析,應(yīng)用MEGA 4.1 軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 人工感染

將菌株201901141 和201901142 分別接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18h，用無菌生理鹽水將菌液依次稀釋至濃度為2.57×104CFU/mL、2.57×105CFU/mL、2.57×106CFU/mL、2.57×107CFU/mL、2.57×108CFU/mL 和2.57×109CFU/mL。以上各濃度的菌液,以0.3mL/尾的劑量分別腹腔注射10 尾，作為感染組；以腹腔注射同劑量無菌生理鹽水為對(duì)照組。接種后觀察魚的發(fā)病、死亡情況，解剖發(fā)病死亡的魚，再進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。根據(jù)改進(jìn)的寇式法[12]計(jì)算半致死劑量。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法。分別用無菌生理鹽水稀釋201901141 和201901142 的新鮮菌液，取100μL 菌液到普通營養(yǎng)瓊脂平板上均勻涂布，用無菌鑷子將藥敏紙片平鋪在上面，每種藥片設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于37℃培養(yǎng)48h 后，測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)“美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI-M100-S19）[13]”判定該菌對(duì)抗生素藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌感染實(shí)驗(yàn)

人工感染后，加州鱸的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的魚相似，肝臟充血、腸道潰爛，從發(fā)病死亡魚體內(nèi)可再次分離到與原菌株形態(tài)相同的菌落，經(jīng)鑒定證實(shí)為原感染細(xì)菌，表明菌株201901141 和201901142即為該病的病原菌。經(jīng)計(jì)算，菌株201901141 和201901142 對(duì)健康加州鱸的半致死劑量分別為5.13×105CFU/g 和6.46×105CFU/g（表1）。

2.2 形態(tài)特征

分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)48h 后,菌落為灰白色，表面光滑，半透明，形成不規(guī)則的濕潤(rùn)薄膜狀菌苔。在肉湯37℃振蕩培養(yǎng)18h，菌液均勻渾濁，底部略有沉淀。

2.3 生理生化特性

生理生化試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示：2 株菌能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、木糖，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、甘露糖和纖維二糖，能分解尿素，還原硝酸鹽，利用西蒙氏檸檬酸鹽，MR、硫化氫、動(dòng)力試驗(yàn)顯陽性，VP、山梨醇、七葉苷、衛(wèi)茅醇、水楊素、肌醇、β-半乳糖苷試驗(yàn)顯陰性。將生化試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]比對(duì)，菌株201901141和201901142 的生理生化特性均符合普通變形桿菌的特性。

2.4 16S rRNA 基因序列分析

將測(cè)序得到的菌株201901141 和201901142的16S rRNA 基因序列（MN491930 和MN490046）分別在GenBank 中進(jìn)行BLAST 分析,顯示與普通變形桿菌的同源性分別為100%和99.86%。根據(jù)上述序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株201901141 和201901142 與普通變形桿菌（KT794006）聚為一支（圖1），結(jié)合形態(tài)和生理生化特性，證實(shí)為普通變形桿菌。

2.5 體外藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，普通變形桿菌201901141和201901142 均對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林、氟苯尼考、四環(huán)素、米諾環(huán)素、奧復(fù)星、卡那霉素、慶大霉素、淋必治和丁胺卡那高度敏感；對(duì)羧芐西林、氨芐西林-舒巴坦、新霉素中度敏感；對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛、先鋒霉素Ⅴ、氨芐西林、苯唑西林、阿奇霉素、多粘菌素B、潔霉素、克林霉素不敏感（表3）。

表1 病原菌株201901141 和201901142 感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Infection test results of strains of bacterial pathogen 201901141 and 201901142

表2 菌株201901141 和201901142 的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strains 201901141 and 201901142

表3 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of the drug sensitivity test

3 討論

普通變形桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬Proteus，是一種革蘭氏陰性桿菌，無芽孢、無莢膜，廣泛存在于水、土壤、腐敗的有機(jī)物以及人和動(dòng)物的腸道中，有明顯的多形性，在固體培養(yǎng)基上常呈擴(kuò)散生長(zhǎng)[15]。目前普遍認(rèn)為，16S rRNA 基因的同源性大于97.5%的細(xì)菌菌株可視為同種，而同屬的16S rRNA 基因的同源性應(yīng)大于或等于90%[16]。菌株201901141 和201901142 的16S rRNA 基因序列經(jīng)BLAST 比對(duì)后，與普通變形桿菌的同源性分別為100%和99.86%，均高于97.5%，且與普通變形桿菌以100%的置信度聚為一支。綜合形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16S rRNA 基因序列分析,鑒定分離菌為普通變形桿菌。人工感染表明：兩株菌的半致死劑量分別為5.13×105CFU/g 和6.46×105CFU/g，表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病力。再次從魚體肝、腎臟分離的優(yōu)勢(shì)菌株普通變形桿菌也為本次引發(fā)加州鱸疾病的病原。送檢病魚和回歸感染的加州鱸身體均出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，肝、腎臟充血，這與普通變形桿菌感染大口鯰[8]和斑點(diǎn)叉尾[11]的癥狀基本相同。變形桿菌通過菌毛黏附在宿主細(xì)胞上，快速滋生鞭毛和多糖莢膜,在宿主細(xì)胞內(nèi)釋放大量溶血素、尿素酶、溶蛋白酶等毒力因子,使宿主發(fā)病[11]。已報(bào)道的危害加州鱸的病原細(xì)菌主要有洋蔥霍爾德氏菌Burkhol cepacid[17]、維氏氣單胞菌Aeromonas veronii[18]、溫和氣單胞菌A.sobria[19]、遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda[20]、白皮極毛桿菌Pseudomonas dermoalba、柱狀纖維粘細(xì)菌Cytophaga columnaris、諾卡氏菌Nocardia seriolae、嗜水氣單胞菌A.hydrophila、柱狀黃桿菌Flavobacterium columnare[21,22]，而變形桿菌屬感染加州鱸致病的報(bào)道極少，目前僅夏理海等[23]報(bào)道變形桿菌、維氏氣單胞菌和虹彩病毒Megalocytivirus 共同感染加州鱸，普通變形桿菌單獨(dú)引發(fā)加州鱸疾病尚屬首次。普通變形桿菌是人畜魚共患重要病原之一，雖是條件致病菌，但在高密度、大規(guī)模養(yǎng)殖模式下，也容易引發(fā)大規(guī)模病害[24]。普通變形桿菌作為一種食源性的條件致病菌廣泛存在于自然界，要避免其危害水產(chǎn)動(dòng)物，就要從食物端做好管理，切斷傳播途徑。

目前，防控魚類細(xì)菌病害的主要手段還是使用抗生素[25]。抗生素藥敏試驗(yàn)表明：兩株菌對(duì)四環(huán)素類、氨基酸糖苷類、氯霉素類、氟喹諾酮類藥物高度敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、脂肽類、林可酰胺類藥物不敏感；對(duì)頭孢類和青霉素類部分藥物敏感。兩菌株對(duì)慶大霉素、卡那霉素和氟苯尼考敏感，對(duì)克林霉素、苯唑西林耐受，這與楊移斌等[11]和曹海軍等[8]的研究一致；對(duì)四環(huán)素敏感，這與李槿年等[6]的結(jié)果不一致，可能是不同地區(qū)和水環(huán)境以及各地區(qū)用藥不同所致[26]。雖然與中華鱉[6]、大口鲇[8]、斑點(diǎn)叉尾[11]這些水產(chǎn)動(dòng)物分離到的普通變形桿菌耐藥情況不盡相同，但本次實(shí)驗(yàn)所用大部分抗生素對(duì)加州鱸源普通變形桿菌還較為敏感，適當(dāng)使用抗生素治療，可減少經(jīng)濟(jì)損失。本研究中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可為防治加州鱸普通變形桿菌病時(shí)合理用藥提供參考。