魚類卵母細(xì)胞減數(shù)分裂機(jī)制研究進(jìn)展

史秀蘭，徐革鋒，黃天晴，谷偉，程琳，姚作春，陳春山，王麗薇，王炳謙

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070 2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海200120 3.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102110）

1 魚類減數(shù)分裂分子機(jī)制

1.1 減數(shù)分裂的啟動(dòng)

目前，人們廣泛研究了魚類減數(shù)分裂的啟動(dòng)機(jī)制。魚類在繁衍過程中，為使得親代與子代的染色體數(shù)目恒定，遺傳物質(zhì)穩(wěn)定遺傳，在配子形成中，生殖細(xì)胞會(huì)發(fā)生精確的減數(shù)分裂，而魚類性別決定和生殖細(xì)胞的分化正與這過程相關(guān)。

減數(shù)分裂的啟動(dòng)時(shí)間與魚類性別分化密不可分[1]。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，若是形成卵母細(xì)胞，減數(shù)分裂在胚胎期發(fā)生；若形成精母細(xì)胞，減數(shù)分裂在出生后發(fā)生。在13.5dpc（days post copulation，DPC）左右時(shí)，雌雄小鼠生殖細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)差異。這時(shí)卵原細(xì)胞開始啟動(dòng)減數(shù)分裂，在胚胎時(shí)，卵原細(xì)胞增殖，且已經(jīng)歷了減數(shù)分裂的細(xì)線期、偶線期和粗線期，之后在雌鼠性成熟時(shí)卵母細(xì)胞將停滯在雙線期，隨之在卵泡刺激素、黃體生成素、雌激素等共同作用下，停滯在減數(shù)第一次分裂的初級(jí)卵母細(xì)胞重新啟動(dòng)減數(shù)分裂，最終排出成熟的卵子。雄性小鼠與雌鼠不同，精原細(xì)胞在胚胎期并不啟動(dòng)減數(shù)分裂，在胚胎發(fā)生后期就進(jìn)入靜息狀態(tài)。脊椎動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動(dòng)時(shí)間與最終發(fā)育成卵子還是精子有關(guān)[2]。有研究表明，從魚類生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)時(shí)間來看，雌性明顯早于雄性，如尼羅羅非魚Oreochromis niloticu 雌性卵巢生殖細(xì)胞的減數(shù)第一次分裂大約在孵出后30d，而雄性精巢生殖細(xì)胞到孵化后70d 左右時(shí)開始減數(shù)分裂[3]。這一結(jié)論，還需要進(jìn)一步探討。

1.2 減數(shù)分裂信號(hào)通路

魚類卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟是由垂體促性腺激素，卵巢衍生生長(zhǎng)因子和性類固醇共同進(jìn)行復(fù)雜的協(xié)調(diào)。眾所周知，類固醇激素，尤其是雌激素和孕激素，分別與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和減數(shù)分裂恢復(fù)有關(guān)[4]。卵母細(xì)胞從減數(shù)分裂開始到成熟卵子排出受各通路的調(diào)控。這些通路調(diào)控著減數(shù)分裂的啟動(dòng)、阻滯與恢復(fù)，其最新研究進(jìn)展概述如下。

1.2.1 RA 信號(hào)通路

近幾年，對(duì)哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂通路的研究成果（圖1）運(yùn)用到魚類的研究中，表明視黃酸（Retinoic Acid:RA）可能是MIS（feminizing meiosis-inducing substance，MIS）的類似物[5]，是視黃醇（retinol，ROL）在體內(nèi)發(fā)生代謝后產(chǎn)生的主要活性物質(zhì)，這種活性對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和機(jī)體免疫系統(tǒng)有重要作用，同時(shí)若RA 過度增加對(duì)細(xì)胞的增殖分化有產(chǎn)生抑制作用。RA 的合成分為兩步，第一步為以視黃醇為底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，由醇脫氧酶（alcohol dehydrogenases，ADHs）和視黃醇脫氧酶（retinol dehydrogenases，RDHs）進(jìn)行催化，將ROL 轉(zhuǎn)化成視黃醛（retinal），第二步在視黃酸脫氫酶（RALDH）和RA 合成酶ALDH1A 家族（ALDH1A1、1A2 和1A3）的催化下將視磺醛轉(zhuǎn)化成RA[7]。RA 由肝臟分泌的視黃醇結(jié)合蛋白（retinal-binding protein，RBP4）在血清中攜帶，釋放后被周圍細(xì)胞吸收。而RA 的分解由三種細(xì)胞色素P450（CYP26）酶（CYP26A1[8]、CYP26B1[9]和CYP26C1[10]）完成。在細(xì)胞色素P450s 酶少或沒有時(shí)，細(xì)胞核RA 受體（retinoic acid receptor，RAR）與RA 結(jié)合，促進(jìn)RA 調(diào)控的發(fā)育靶基因轉(zhuǎn)錄。RAR 與RA 類受體（retinoid X receptors，RXR）形成異二聚體結(jié)合到RA 反應(yīng)元件（RARE）上，所構(gòu)成的三元復(fù)合物通過改變共壓因子和與輔激活因子的結(jié)合來調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄（圖2）。蔣汶洮[12]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚中具有完整且獨(dú)立的RA 的信號(hào)通路，雌性羅非魚減數(shù)分裂的起始需要內(nèi)源RA 的合成，雌激素對(duì)性腺中RA 水平也有調(diào)節(jié)作用，硬骨魚類和其他脊椎動(dòng)物的減數(shù)分裂可能都需要RA，分解酶或合成酶影響RA 含量。

1.2.2 DHP 信號(hào)通路

孕激素（DHP）在生殖細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂順利排出成熟配子過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，發(fā)現(xiàn)具有生物活性的孕激素僅兩種，即17,20β-DHP和20β-S。其中，絕大多數(shù)硬骨魚類的孕激素是17,20β-DHP，少數(shù)是20β-S[13]。

目前多種硬骨魚類的核受體Pgr（Progesterone receptors，PGR）已被克隆出來，且細(xì)胞表達(dá)模式依魚種類的不同而異[14-16]。Chen 等[14]對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的離體培養(yǎng)試驗(yàn)表明Pgr 最主要的配體是DHP，結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并激活下游基因的表達(dá)。在魚類卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，成熟促進(jìn)因子MPF、成熟誘導(dǎo)激素MIH 和促性腺激素LH 三者共同發(fā)揮關(guān)鍵的誘導(dǎo)調(diào)控作用。三者的作用機(jī)制是：促性腺激素進(jìn)入卵泡濾泡層細(xì)胞，在相關(guān)的內(nèi)固醇合成酶作用下合成成熟誘導(dǎo)激素，成熟誘導(dǎo)信號(hào)經(jīng)過環(huán)腺苷酸（cAMP）通路驅(qū)動(dòng)成熟促進(jìn)因子的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基的合成途徑，由產(chǎn)生的成熟誘導(dǎo)因子作用下游靶基因，使停滯的減數(shù)分裂過程得以恢復(fù)[17]。在魚類卵母細(xì)胞成熟和成熟卵子排出時(shí)期，合成17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）到合成DHP 存在迅速轉(zhuǎn)變過程，在排卵前的48h，卵泡會(huì)有從分泌E2 到分泌DHP 的轉(zhuǎn)變，在血清中DHP 含量達(dá)到峰值時(shí)，使得卵子最終成功排出[18]。劉剛[19]報(bào)道，核受體Pgr 基因在減數(shù)分裂啟動(dòng)的關(guān)鍵時(shí)期特異表達(dá)于精巢和卵巢中，若阻斷了DHP 信號(hào)通路，魚生殖細(xì)胞數(shù)量顯著減少，由此可推斷DHP 通過其核受體Pgr 在硬骨魚類減數(shù)分裂啟動(dòng)過程中起到關(guān)鍵作用。

1.2.3 cAMP 信號(hào)通路

魚類性成熟過程中，卵母細(xì)胞停留在減數(shù)第一次分裂前期，在這期間，高濃度cAMP 協(xié)同類固醇激素（如孕酮P4）或其他成熟抑制因子維持減數(shù)分裂的停滯。對(duì)cAMP 信號(hào)通路，即第二信使的雌激素信號(hào)通路的研究已經(jīng)非常透徹了。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，Gαs蛋白在其耦聯(lián)受體3（Gs-protein-coupling receptor 3，GPR3）作用下，活化腺苷酸環(huán)化酶（AC）促進(jìn)cAMP 的合成，使cAMP 在卵母細(xì)胞內(nèi)的濃度變高，減數(shù)分裂停滯[20]。黃體生成激素（LH）的釋放使GPR3 的配體失活或合成減少，導(dǎo)致GPR3 的活性降低；隨后G蛋白受體激酶再通過磷酸化GPR3下調(diào)其活性，減數(shù)第一次分裂得以恢復(fù)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，不同生物體內(nèi)cAMP 信號(hào)的通路不同。

研究發(fā)現(xiàn)，非洲爪蟾Xenopus laevis 卵母細(xì)胞cAMP 通路中，cAMP 降低水平與減數(shù)分裂停滯的釋放無關(guān)；膜通道檢測(cè)時(shí)，cAMP 或PKA 的變化并未隨孕酮（P4）的改變而改變，減數(shù)分裂停滯后，PKA活性不會(huì)發(fā)生變化，增加cAMP 水平不會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟的水平[21]。對(duì)于硬骨魚類，體外添加外源性雌二醇（E2）的濃度越高，卵母細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的cAMP 濃度越高，從而卵母細(xì)胞的成熟受到抑制[22]。研究已證實(shí)，E2 主要通過與其膜受體-G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）結(jié)合來調(diào)控魚類卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯和恢復(fù)。Thomas 等研究發(fā)現(xiàn)，用芳香酶抑制劑體外培養(yǎng)的大西洋黃花魚Micropogonias undulatus 和斑馬魚Danio rerio 細(xì)胞自發(fā)成熟水平增加，添加外源E2 的作用是可逆的。同樣，通過向培養(yǎng)基中添加E2，可以減弱MIS 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟[23,24]。手動(dòng)或酶促剝離卵母細(xì)胞卵泡層，以去除其內(nèi)源性雌激素源干擾，顯示出成熟率增加。研究結(jié)果表明，這與雌激素對(duì)魚的減數(shù)分裂細(xì)胞周期進(jìn)程中的抑制作用一致。

最近的研究表明，在這種通路中，雌激素對(duì)魚卵母細(xì)胞成熟的抑制是通過其跨膜受體，即GPER介導(dǎo)的。繼哺乳動(dòng)物研究之后，Peyton 和Thomas 的研究表明，雌激素對(duì)卵母細(xì)胞成熟的抑制作用是通過Gper 介導(dǎo)的[25]。GPER 先前定位于卵母細(xì)胞表面，在卵母細(xì)胞表面高度表達(dá)。Peyton 和Thomas 證實(shí)[26]，缺乏雌激素的斑馬魚卵母細(xì)胞表現(xiàn)出高度的自發(fā)成熟。添加E2-牛血清蛋白（不含膜的雌激素）阻斷了卵母細(xì)胞的自發(fā)成熟。進(jìn)一步的研究表明，GPER特異性激動(dòng)劑（G-1）減弱了自發(fā)性卵母細(xì)胞的成熟，且GPER 特異性拮抗劑（G-15）阻斷了E2 對(duì)卵母細(xì)胞成熟的抑制作用。脊椎動(dòng)物（哺乳動(dòng)物和魚類）的驗(yàn)證表明，GPER 的基本功能作為膜雌激素受體這一觀點(diǎn)取得了更有力的支持[27]。

2 魚類減數(shù)分裂特異性基因

近幾年，關(guān)于Stra8、Scp3、Dmc1 和Spo11 等減數(shù)分裂特異性基因的研究逐漸增多，相關(guān)信號(hào)通路的驗(yàn)證往往與特異性基因分不開。研究者們致力于探究減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的啟動(dòng)時(shí)間、發(fā)生過程以及各通路之間的相互影響和作用的同時(shí)，也在尋找與減數(shù)分裂相關(guān)的特異性表達(dá)基因。這里著重介紹幾個(gè)調(diào)控魚類減數(shù)分裂的特異性基因。

對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類的研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂結(jié)束開始減數(shù)分裂前，Stra8 基因是這時(shí)期的特異性表達(dá)基因，在調(diào)控減數(shù)分裂的起始過程中起非常重要的角色。若Stra8 缺失，生殖細(xì)胞將不能完成減數(shù)分裂[28-30]。早期，對(duì)青鱷Crocodylus siamensis、斑馬魚Danio rerio、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes 和黑青斑河鲀Tetraodon nigroviridis 等的基因組序列分析中，并沒有發(fā)現(xiàn)Stra8 的同源基因[31]。近幾年，焦靜等[32]從幾種硬骨魚類，如溝鲇Parasilurus asotus、虹鱒Onchorrhychus mykiss 等魚中分離到了基因Stra8，其在性腺中特異性地表達(dá)，說明Stra8 基因在減數(shù)分裂啟動(dòng)中的重要作用。

Dmc1（Disrupted meiotic cDNA）是在減數(shù)分裂前期偶線期表達(dá)的特異基因,其表達(dá)產(chǎn)物為同源染色體配對(duì)時(shí)所必需。Dmc1 蛋白在真核生物中發(fā)現(xiàn)，是大腸桿菌Escherichia coli RecA 蛋白的同源蛋白。Dmc1 基因是減數(shù)分裂重組和聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex,Sc）的關(guān)鍵組分[33,34]。早期研究人員發(fā)現(xiàn)DMC1 蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂特異的重組蛋白，僅在精原細(xì)胞和胚胎時(shí)期的卵母細(xì)胞中表達(dá)。小鼠Dmc1 基因在減數(shù)分裂Ⅰ細(xì)線期到偶線期的過程中特異表達(dá)，為同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)必需[35]。若Dmc1 基因突變或者被敲除，直接導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯在偶線期，不出現(xiàn)同源染色體聯(lián)會(huì)或者出現(xiàn)異常聯(lián)會(huì)[36]。在魚類研究中，如日本鰻鱺Anguilla japonica、紅鯽Carassius auratus red var.、湘江野鯉Cyprinus carpio L.、日本白鯽Carassius cuvieri、湘云鯽和鯽鯉等魚類中發(fā)現(xiàn)，Dmc1 基因僅在減數(shù)分裂間期早期表達(dá)[37]。在陶敏等研究發(fā)現(xiàn)，Dmc1 基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)與倍性無顯著相關(guān)性[38]。

聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex，SC）是一種框架狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合體，發(fā)生在配子形成過程中減數(shù)分裂偶線期同源染色體配對(duì)時(shí)形成的一種核內(nèi)臨時(shí)結(jié)構(gòu)[39]。這種聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白質(zhì)（Synaptonemal complex protein，SCP）由Scp1、Scp2 和Scp3 三種蛋白構(gòu)成[40-42]。其中Scp1 是主要構(gòu)成SC 的中心和軸向蛋白[43,44]。而Scp2 和Scp3 則是主要組成SC 的橫向蛋白[45-47]，其中Scp3 具有DNA 結(jié)合位點(diǎn)，廣受學(xué)者們的關(guān)注。SCP 最早在減數(shù)分裂前期的細(xì)線期形成，雙線期消失；SCP 與同源染色體的凝集、配對(duì)、重組以及雙鏈斷裂密切相關(guān)[48,49]。若SCP 基因缺失，減數(shù)分裂不能進(jìn)入后期或出現(xiàn)非整倍體配子。近幾年，研究者們已經(jīng)分析和驗(yàn)證了哺乳動(dòng)物如大小鼠、牛、絨山羊等以及人的Scp3 基因功能。在硬骨魚類中，目前在虹鱒[50]、青鳉Oryzias latipes[51,52]、斑馬魚等模式魚中有研究，證明Scp3 基因僅在性腺中表達(dá)，可作為減數(shù)分裂特異性標(biāo)記基因。

Spo11 是減數(shù)分裂粗線期染色體重組過程中不可或缺的蛋白，參與DNA 雙鏈斷裂復(fù)合物（Double-Strand breaks，DSB）的形成。近幾年，已在多種脊椎動(dòng)物克隆了Spo11 基因，可推斷此基因可能在其他物種減數(shù)分裂進(jìn)程中具有保守功能[53，54]。但在日本鰻鱺Anguilla japonica 中發(fā)現(xiàn)，Spo11 基因僅在精母細(xì)胞中有表達(dá)，而在卵黃發(fā)生早期沒有發(fā)現(xiàn)[54]，表明Spo11 基因在硬骨魚類的表達(dá)模式與其他物種并不完全一致。尚婉婧等[55]對(duì)尼羅羅非魚的研究表明，Spo11 基因僅在性腺特異性地表達(dá)，且雌性生殖細(xì)胞的表達(dá)早于雄性。Spo11 基因適合作為性腺分化早期，生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的標(biāo)志基因。

3 展望

近年來，對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程調(diào)控機(jī)制的研究日益增多，面對(duì)這一應(yīng)用基礎(chǔ)領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們不只局限于植物和哺乳動(dòng)物的研究，在兩棲動(dòng)物如爪蟾，硬骨魚類的探究也越來越多。多倍體魚類不育，在生長(zhǎng)過程中較正常二倍體具有更多的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。研究二者在減數(shù)分裂過程中的差異是關(guān)鍵的一步。減數(shù)分裂的啟動(dòng)過程，與魚類性別分化和性腺發(fā)育的關(guān)系密不可分，從這一方面入手，有利于實(shí)現(xiàn)人工控制魚類倍性，對(duì)提高生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益有突出貢獻(xiàn)。