牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌三重 PCR快速檢測方法的建立

楊 莉, 余 波, 張 濤, 姜玲玲,劉 鏡, 楊麗娟, 孫啟躍, 徐景峨,龍 玲, 唐遠江, 余國富, 鄒茂華, 吳位珩*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005； 2.貴州省清鎮(zhèn)市動物疫病疫防控制中心，貴州 清鎮(zhèn) 551400； 3.貴州省黔西縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔西 551500)

牛呼吸道疾病病原復(fù)雜，主要由牛支原體、牛結(jié)核分枝桿菌和牛巴氏桿菌等病原菌引起。牛支原體病常常繼發(fā)或混合感染牛巴氏桿菌，從而加重病情，感染牛呼吸急促、流涎、發(fā)燒、肺炎、急性胃腸炎以及內(nèi)臟器官廣泛出血，嚴重的造成死亡[1]。牛結(jié)核分枝桿菌主要是呼吸道傳播的慢性消耗性疾病，病牛在初期食欲正常，主要呈現(xiàn)頑固性的咳嗽，后期肺部病變嚴重時，表現(xiàn)呼吸困難，咳嗽加重，流膿性鼻汁，胸部聽診有干性或濕性特征，有時可聽到摩擦音，病畜日漸消瘦、貧血等[2]。在臨床和病理解剖情況下，3種疾病難以區(qū)分，容易混淆。目前常用的實驗室診斷方法有細菌學(xué)檢測、病原菌分離培養(yǎng)、生化試驗、動物回歸試驗、免疫學(xué)診斷等，但這些方法所需時間長、操作繁瑣、準確性低，很難適應(yīng)臨床快速診斷的需要。因此，根據(jù)PCR原理，分別針對牛支原體oppD基因序列、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因序列、牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列設(shè)計了特異性引物，建立快速、準確檢測這3種疾病的PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 牛支原體菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院惠贈，多殺性巴氏桿菌(cvcc1663)、牛分枝桿菌參考菌株[編號為93006(4)]、魏氏梭菌、禽源多殺性巴氏桿菌均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，豬源支原體、嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牛衣原體、羊衣原體、金色葡萄球菌DNA模板均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室提供。

1.1.2 生化試劑及主要儀器

試劑：Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑盒(試劑條、磁棒套、緩沖液ATL、洗脫液等)和DTT試劑均購于廈門致善生物科技股份有限公司，Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、EDTA、Tris-HcL、瓊脂糖、DL2000 Marker、Premix Taq Version 2.0(E×Taq Version 2.0 plus dye)及去離子水購于天根生化科技(北京)有限公司,PPLO肉湯培養(yǎng)基和PPLO固體培養(yǎng)基購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司,改良羅氏培養(yǎng)基購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，特級馬血清、酵母粉和精氨酸胰蛋白胨購自北京索萊寶科技有限公司。

儀器：核酸提取儀(Lab-Aid 820，廈門百維信生物科技有限公司)，電子天平(AR2140，美國奧豪斯)，高速離心機(D3024，北京大龍)，pH測量儀(Delta 320A/c，梅特勒-托利多)，梯度PCR擴增儀(BIOMETRA，德國)，電泳儀(DDY-10C，北京六一生物科技有限公司)，紫外透射儀、凝膠成像儀(BIO-RAD Gel Doc XR，美國伯樂)，超純水器(ATZ-10-T，臺灣艾科蒲)，紫外可見光度計(Implen NanoPhotomet，德國)，移液器(芬蘭)，移液頭、PCR離心管(美國)。

1.2 引物的設(shè)計與合成

分別對牛支原體oppD基因序列(擴增片段為226 bp，Genbank上的登錄號為AF130119.1)、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因序列(擴增片段為638 bp，登錄號為AF016259.1)、牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列(擴增片段為478 bp，登錄號為X57835.2)應(yīng)用Primer Primer5.0基因分析軟件設(shè)計特異性引物，引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，具體引物如下：

牛支原體上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′，下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′；牛多殺性巴氏桿菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′，下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′；牛結(jié)核分枝桿菌上引物：5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′，下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。

1.3 模板處理及基因組提取

1.3.1 參考菌株DNA的提取 牛支原體采用PPLO培養(yǎng)基培養(yǎng)，牛多殺性巴氏桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，牛結(jié)核分枝桿菌采用改良羅氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，魏氏梭菌和禽源多殺性巴氏桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。取培養(yǎng)菌液1 500 μL于1.5 mL的離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，收集沉淀。將試劑條的左邊第1孔溶液取出加入到收集的沉淀中，用移液管反復(fù)吹打使沉淀物充分懸浮，處理完畢后，將之取出在試劑條的左邊第1孔中，同時加入30 μL配制好的DTT溶液，混勻。將試管條架放入核酸提取儀中,試管條架推到位，按核酸提取Mini試劑盒使用說明書中核酸提取儀操作步驟進行。

1.3.2 臨床組織樣本DNA的提取 取樣本組織少許，用滅菌手術(shù)剪剪碎，加入900 μL生理鹽水，反復(fù)凍融3次，然后5 000 r/min離心5 min，取700～900 μL上清液，加入蛋白酶K 20 μL，10%SDS液100 μL，55℃水浴箱中加熱30 min至組織消化完全，取出冷卻。將核酸提取Mini試劑條在桌面輕輕磕碰，使各試劑落入管底，然后將試劑條放在試管條架上，撕去封管膜，在試劑條左邊第1孔中加入完全消化的組織液200 μL和30 μLDTT溶液，混勻。將試管條架放入核酸提取儀中,試管條架推到位，按核酸提取Mini試劑盒使用說明書中核酸提取儀操作步驟進行。

1.3.3 牛全血樣本DNA的提取 取待檢樣本全血1 mL于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2～5 min，棄上清液，沉淀采用生理鹽水清洗2次，棄上清液。加入TE緩沖溶液200 μL，蛋白酶K 40 μL，裂解液160 μL，充分混勻，置60℃水浴15～20 min，加入無水乙醇200 μL，充分搖勻，簡短離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上述溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)12 000 r/min離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500 μL 70%乙醇，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，用同樣方法，采用70%乙醇，再清洗1次，去廢液。將吸附柱放入收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱放置室溫中5～10 min，晾干。將晾干的吸附柱放入干凈的收集管中，加入TE緩沖溶液60～100 μL，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到冷藏管中，即為提取的DNA模板，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR體系的建立

1.4.1 單一PCR體系的建立 25 μL初始反應(yīng)體系：Premix Taq (E×Taq Version 2.0 plus dye)為12.5 μL，牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌DNA模板為2 μL，分別加入對應(yīng)的特異性引物各1 μL，加入dd H2O至25 μL，同時設(shè)陰性對照組。初始擴增程序：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 40 s，58℃ 40 s,72℃60 s，循環(huán)30次；72℃ 7 min延伸。在選擇最佳的退火溫度時,設(shè)置梯度PCR，并對引物濃度、Mg2+濃度、模板DNA用量等重要參數(shù)進行優(yōu)化試驗，反應(yīng)結(jié)束后將擴增產(chǎn)物取5～7 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 三重PCR體系的建立 100 μL初始反應(yīng)體系： Premix Taq (E×Taq Version 2.0 plus dye)為50 μL，牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌DNA模板各4 μL，3對上、下引物各2 μL，加入ddH2O至100 μL，同時設(shè)陰性對照組。根據(jù)單一PCR體系，設(shè)置初始擴增程序：94℃ 10 min預(yù)變性；94℃ 1 min，60℃ 50 s,72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min延伸。同時在選擇最佳的退火溫度時設(shè)置梯度PCR，并對引物濃度、Mg2+濃度、模板DNA用量等重要參數(shù)進行優(yōu)化試驗，反應(yīng)結(jié)束后將擴增產(chǎn)物取5～7 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR特異性試驗

1.5.1 單一PCR特異性 分別用牛支原體菌株、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、魏氏梭菌、禽源多殺性巴氏桿菌、豬源支原體、嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牛衣原體、羊衣原體、金色葡萄球菌DNA為模板，加入相應(yīng)的單一PCR引物，按照單一PCR反應(yīng)體系進行擴增和凝膠電泳檢測，同時設(shè)空白對照。

1.5.2 三重PCR特異性 在單一PCR試驗的基礎(chǔ)上，進行三重PCR特異性試驗。依次以牛支原體菌株、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、魏氏梭菌、禽源多殺性巴氏桿菌、豬源支原體、嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牛衣原體、羊衣原體、金色葡萄球菌DNA為模板，分別加入單種引物各1 μL，或者3種引物等體積混合物6μL，單一PCR DNA模板量為2 μL，加入ddH2O至25 μL，同時設(shè)陰性對照組。三重PCR DNA模板量各為4 μL，加入ddH2O至100 μL，同時設(shè)陰性對照組。

1.6 三重 PCR敏感性試驗

采用Nanophotometer微量核酸分析儀對提取的牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌的DNA模板進行核酸含量測定。在進行敏感性試驗時，按10倍稀釋法對DNA模板進行稀釋后，各取4 μL模板混合，加入多重PCR反應(yīng)體系，加ddH2O補至100 μL，進行PCR擴增試驗，同時設(shè)空白對照。

1.7 三重 PCR重復(fù)性試驗

將上述PCR檢測重復(fù)3次驗證方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣本的三重 PCR檢測

對貴州省引進的能繁母牛隔離場采集的牛鼻拭子樣品163份、凱里屠宰場采集的牛肺樣品10份、黔西牛場采集的病死牛肺樣品1份、某牛場采集的牛結(jié)核PPD陽性樣本5份分別進行單一牛支原體PCR檢查和三重PCR檢查；將采集的牛鼻拭子進行24 h增菌后，進行PCR方法檢查。

1.9 三重 PCR產(chǎn)物克隆測序及分析

將三重PCR擴增片段經(jīng)膠回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行克隆和測序，并用BLAST程序?qū)enBank數(shù)據(jù)庫進行序列的同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 三重 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

從圖1看出，三重PCR反應(yīng)在退火溫度為52.5～62℃時能得到比較清晰的PCR產(chǎn)物擴增條帶，且各退火溫度PCR產(chǎn)物的擴增條帶間影響不大。因此，確定該三重PCR退火溫度為60℃。反應(yīng)體系為100 μL，該三重PCR可出現(xiàn)清晰的擴增條帶。在Mg2+濃度為3 mM時，可得到均一、穩(wěn)定、清晰的擴增條帶。比較各引物濃度的擴增效果，結(jié)果確定該三重PCR反應(yīng)的最適合的濃度分別是：oppD為20 μM，Pm-kmt為20 μM，IS6110為20 μM。菌株模板DNA用量為4 μL，退火溫度為60℃，循環(huán)數(shù)為30次，擴增出來的PCR產(chǎn)物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠形成明亮、清晰、均一的目的條帶。

注：M為Marker DL2000，1為陰性對照，2～9為退火溫度，分別為52℃、54℃、55℃、57℃、59℃、60℃、61℃、62℃。

Note: M, Marker DL2000; 1,negative control; 2～9,annealing temperature of 52℃, 54℃, 55℃, 57℃, 59℃, 60℃, 61℃ and 62℃.

圖1 各退火溫度 PCR產(chǎn)物的擴增條帶

Fig.1 The amplification bands of PCR product at different annealing temperature

2.2 PCR的特異性

2.2.1 單一PCR的特異性 從圖2看出，設(shè)計的特異性均能擴展出牛支原體、牛結(jié)核分枝桿菌、牛多殺性巴氏桿菌相應(yīng)的目標條帶，分別是226 bp、638 bp和478 bp，與預(yù)期大小相符合。

注：M為Marker DL2000，1為陰性對照；2分別為標準牛支原體(A)、標準牛結(jié)核分枝桿菌(B)和標準牛多殺性巴氏桿菌(C)；3分別為牛支原體分離株(A)、牛結(jié)核分離株(B)和牛巴氏桿菌分離株(C)；4為牛結(jié)核分枝桿菌；5為牛支原體；6為牛源大腸桿菌；7為魏氏梭菌；8為禽源多殺性巴氏桿菌；9為豬源支原體；10為嗜血桿菌；11為豬大腸桿菌；12為沙門氏菌；13為牛源衣原體；14為羊源衣原體；15為金色葡萄球菌。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 respresents the standardmycoplasmabovis(A),pasteurellamultocida(B) andmycobacteriumtuberculosis(C) ; 3 respresents the isolated strain ofmycoplasmabovis(A),pasteurellamultocida(B) andmycobacteriumtuberculosis(C); 4 respresentsmycobacteriumbovis; 5 respresentsmycoplasmabovis; 6 respresentsBovinee.coli; 7 respresentsclostridiumwelchii; 8 respresentsPasteurellamultocidafrom poultry; 9 respresentsmycoplasmafrom pig; 10 respresentshaemophilus; 11 respresents swineescherichiacoli; 12 respresentssalmonella; 13 respresents cowchlamydia; 14 respresents sheepchlamydia; 15 respresentsstaphylococcusaureus.

圖2 牛支原體(A)、牛結(jié)核分枝桿菌(B)和多殺性巴氏桿菌(C)的特異性 PCR擴增產(chǎn)物

Fig.2 Specific PCR amplification products ofM.bovis(A),M.tuberculosis(B) andP.muttocida(C)

2.2.2 三重PCR的特異性 從圖3看出，三重PCR反應(yīng)體系能從混合模板和單獨模板中同時擴增出牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌特異性目的條帶，各引物與模板之間沒有明顯的互相干擾。其他的病原菌魏氏梭菌、禽源多殺性巴氏桿菌、豬源支原體、牛源大腸桿菌、嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牛衣原體、羊衣原體、金色葡萄球菌均未出現(xiàn)目的條帶，說明該三重PCR特異性良好。

注：M為Marker DL2000，1為陰性對照，2為3種病原菌混合模板，3為牛巴氏桿菌分離株，4為牛結(jié)核分枝桿菌，5為牛支原體，6為牛源大腸桿菌，7為魏氏梭菌，8為禽多殺性巴氏桿菌，9為豬源支原體，10為嗜血桿菌，11為豬源大腸桿菌，12為沙門氏菌，13為牛源衣原體，14為金色葡萄球菌。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 respresents mixed pathogenic bacteria; 3 respresents bovinepasteurellaisolates; 4 respresentsmycobacteriumbovis; 5 respresentsmycoplasmabovis; 6 respresents Bovine e. coli; 7 respresents clostridium welchii; 8 respresentsPasteurellamultocidafrom poultry; 9 respresentsmycoplasmafrom pig; 10 respresentshaemophilus; 11 respresents swineescherichiacoli; 12 respresentssalmonella; 13 respresents cowchlamydia; 14 respresents sheepchlamydia; 15 respresentsstaphylococcusaureus.

圖3 三重 PCR特異性試驗結(jié)果

Fig.3 Results of triple PCR specificity test

2.3 三重 PCR的敏感性

敏感性試驗結(jié)果顯示：牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌的DNA模板最高稀釋倍數(shù)分別是10-4倍、10-4倍和10-6倍，對應(yīng)的牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌的DNA模板濃度分別是5.306×10-3ng/μL、3.075×10-2ng/μL和1.605×10-4ng/μL，三重PCR較單一PCR的靈敏度降低了100倍(圖4)。

注：M：Marker DL2000；1：陰性對照；2：原液；3：10-1倍稀釋液； 4：10-2倍稀釋液；5：10-3倍稀釋液；6：10-4倍稀釋液； 7：10-5倍稀釋液；8：10-6倍稀釋液 。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 represents the original solution; 3 respresents 10-1diluent; 4 respresents 10-2diluent; 5 respresents 10-3diluent; 6 respresents 10-4diluent; 7 respresents 10-5diluent; 8 respresents 10-6diluent.

圖4 三重 PCR敏感性試驗結(jié)果

Fig.4 Results of triple PCR sensitivity test

2.4 三重 PCR的重復(fù)性

用建立的三重PCR方法重復(fù)檢測牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌DNA樣品，3次結(jié)果均一致，說明方法的重復(fù)性良好。

2.5 三重 PCR擴增產(chǎn)物序列的同源性

擴增的牛支原體oppD基因的226 bp片段、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因的638 bp片段、牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因478 bp片段送檢測序結(jié)果分別與GenBank中已發(fā)表的牛支原體oppD基因(登錄號：AF130119.1)、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因(登錄號：AF016259.1)、牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因(登錄號：X57835.2)中相應(yīng)片段核苷酸序列同源性均在98%以上，表明該三重PCR擴增產(chǎn)物的序列是正確的。

2.6 臨床樣本檢測

163份牛鼻拭子樣品單一牛支原體PCR檢查出陽性樣本60份，三重牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌PCR檢測陽性樣本60份；牛鼻拭子進行24 h增菌后牛支原體PCR陽性檢出樣本65份，與未培養(yǎng)的樣本陽性符合率為92.3%。凱里屠宰場采集的10份(頭)牛肺單一PCR檢測為陰性，三重PCR檢測也為陰性。黔西牛場采集的1份(頭)樣品單一PCR多殺性巴氏桿菌檢測為陽性，三重PCR檢測也為陽性。某牛場采集的5份(頭)牛結(jié)核PPD陽性樣本中，牛結(jié)核單一PCR檢測陽性樣本4份(頭)，三重牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌PCR檢測陽性樣本4份。表明，各樣本單一PCR檢查和三重PCR檢測陽性符合率均為100%。

3 結(jié)論與討論

試驗在對單一PCR進行優(yōu)化后建立了三重PCR，通過優(yōu)化試驗，確定該三重PCR的最佳擴增條件為：反應(yīng)最適的濃度分別是oppD為20 μM，Pm-kmt為20 μM，IS6110為20 μM。菌株模板DNA用量為4 μL，退火溫度為60℃，循環(huán)數(shù)為30。研究建立的三重PCR檢測方法具有準確、特異、快速的特點，可同時檢測牛支原體、牛多殺性巴氏桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌3種呼吸道致病菌，并在臨床應(yīng)用上取得了較好的效果，各樣本三重PCR檢測結(jié)果與單一PCR檢查符合率為100%。

牛支原體oppD基因已被證實在牛支原體中高度保守且是牛支原體的特異性基因。2015年袁海文等[3]對牛支原體貴州流行株oppD/F基因進行的克隆、測序及序列分析表明，牛支原體貴州株與湖北株、重慶株及內(nèi)蒙古株親緣關(guān)系最近，與牛支原體國際標準株P(guān)G45處于同一進化分支上，但已呈現(xiàn)進化差異性，而與其他支原體如無乳支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、鱷魚支原體親緣關(guān)系較遠，與絲狀支原體絲狀亞種SC型標準株親緣關(guān)系更遠；ATP結(jié)合蛋白oppD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因為目標基因的PCR，已證實能夠較好地區(qū)別牛支原體與牛無乳支原體的感染[4]。趙自云等[5-7]研究表明，序列6110是結(jié)核分支桿菌基因組中的一個多拷貝的保守片段，該序列作為擴增靶序列，有較高的敏感性和特異性，是分子生物學(xué)方法研究結(jié)核桿菌的首選片段。多殺性巴氏桿菌是具有異質(zhì)性特征的病原亞種群，常引起多種動物以敗血癥和呼吸系統(tǒng)疾患為主的疾病。Kmt基因是多殺性巴氏桿菌的種特異性片段，因此，利用Kmt基因的PCR擴增法檢測多殺性巴氏桿菌現(xiàn)已普遍被國內(nèi)外學(xué)者認可[8-10]。綜上研究是試驗針對牛支原體oppD基因序列、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因序列、牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列設(shè)計了特異性引物的基礎(chǔ)。

臨床樣本進行牛支原體分離培養(yǎng)需2～4 d，牛結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)需10～15 d，而牛多殺性巴氏桿菌的分離培養(yǎng)與上述2種病原菌一樣，培養(yǎng)復(fù)雜、費時，要求營養(yǎng)高，分離培養(yǎng)陽性率低，很難適應(yīng)目前基礎(chǔ)生產(chǎn)需要。建立的三重PCR檢測方法能直接出結(jié)果，單一PCR檢測方法與三重PCR檢測方法符合率高達100%，顯著加快了臨床樣本的診斷速度，可為牛呼吸系統(tǒng)疾病的流行病學(xué)調(diào)查及診斷提供實用技術(shù)，具有推廣應(yīng)用價值。