H9亞型禽流感SPF雞發(fā)病模型的構建

周萌　李穎　林樹乾　李桂明　楊世發(fā)　黃中利　宋敏訓　傅劍　殷斌　劉月月　趙增成

摘要：為了構建理想的H9亞型禽流感病毒（AIV）SPF雞發(fā)病模型，對不同日齡SPF雞、不同感染方法進行了預試驗，最后選用SPF青年蛋雞為試驗動物，采用AIV H9N2毒株與大腸桿菌強毒株、IBV M41株各0.5 mL聯(lián)合滴鼻感染的方法，進行了發(fā)病模型構建。結果表明，試驗雞發(fā)病癥狀明顯、病變典型，這為進一步完成H9亞型禽流感防治藥物的臨床療效評價奠定了基礎。

關鍵詞：禽流感;發(fā)病模型;人工感染

中圖分類號：S855.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）05-0117-04

Abstract To construct an ideal H9 subtype avian influenza virus （AIV） incidence model of SPF chicken， the pretest was carried out with different day-old SPF chickens by different infection methods. And then， the young laying SPF hens were selected as experimental animals， and the AIV H9N2 strains were combined with 0.5 mL Escherichia coli virulent strain and 0.5 mL IBV M41 strain for intranasal infection. The results showed that the symptoms of the tested chickens were obvious and the lesions were typical. The construction of this animal model laid the foundation for further evaluation on clinical efficacy of H9 subtype avian influenza prevention and treatment drugs.

Keywords Avian influenza; Animal model;Artificial infection

禽流感（AI）是由A型流感病毒（AIV）感染引起的嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種急性傳染性疾病[1]，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失。生物安全和免疫接種是目前主要的防控手段。但由于AIV易于變異、亞型眾多、各亞型間交叉免疫保護力弱，導致免疫失敗的現(xiàn)象屢屢發(fā)生，為該病的免疫預防帶來了困難[2-4]。研制防治禽流感的有效藥物，對控制禽流感意義重大。在新獸藥的研發(fā)中，成功構建出理想的發(fā)病模型，對科學評價新獸藥的臨床療效具有至關重要的作用。在以往的研究中，禽流感發(fā)病模型的構建常存在以下困難：采用低致病性的H9亞型AIV對SPF雞攻毒時，發(fā)病癥狀非常輕微，臨床上表現(xiàn)不出明顯的癥狀;采用高致病性H5亞型AIV攻毒時，由于毒力過強，發(fā)病雞幾乎100%死亡。以上兩種情況，都不利于對藥物藥效做出正確的評價，嚴重制約了禽流感防治藥物的研發(fā)[5]。H9亞型禽流感在臨床發(fā)病上，通常具有與大腸桿菌、傳染性支氣管炎等混合感染的特點，因而表現(xiàn)出較嚴重的發(fā)病癥狀[6，7]。本研究依據以上特點，采用不同日齡試驗動物、不同攻毒劑量、不同感染途徑，采用混合感染的方式，對H9亞型禽流感人工發(fā)病模型的構建進行了研究，最終確定了一種癥狀明顯、具有特征性病變的人工發(fā)病模型構建方法，可用于禽流感防治藥物的臨床試驗研究。

1 材料與方法

1.1 毒株

H9亞型（H9N2）AIV株，EID50為每0.1 mL 10-6.83;傳染性支氣管炎病毒（IBV） M41株，EID50為每0.1 mL 10-6.50;禽源大腸桿菌c84008株。均由山東省農業(yè)科學院家禽研究所保存。

1.2 試驗動物

35日齡SPF雛雞，130 日齡SPF青年蛋雞。

1.3 試驗方法

1.3.1 雛雞感染預試驗35日齡SPF雛雞，共分為4組，每組6只。一組，每只雛雞肌注H9N2 AIV液0.3 mL，同時肌注大腸桿菌新鮮培養(yǎng)物0.1 mL;二組，每只雞滴鼻接種H9N2 AIV液0.3 mL;三組，每只雞肌注H9N2 AIV液0.3 mL;四組，每只雞肌注大腸桿菌新鮮培養(yǎng)物0.1 mL。攻毒后，每天觀察各組雛雞發(fā)病癥狀及死亡情況，最后剖檢各只雛雞病理變化。

1.3.2 青年蛋雞感染預試驗130日齡SPF青年蛋雞，共分為4組，每組4只。第一組，每只雞用H9N2 AIV液滴鼻0.5 mL;第二組，每只雞用H9N2 AIV液和IBV M41株液各滴鼻0.5 mL;第三組，每只雞用H9N2 AIV液和大腸桿菌新鮮培養(yǎng)液各滴鼻0.5 mL;第四組，每只雞用H9N2 AIV液、大腸桿菌液、IBV M41株液各滴鼻0.5 mL。攻毒后，每天觀察各組青年蛋雞發(fā)病癥狀及死亡情況，最后剖檢記錄病理變化。

1.3.3 發(fā)病模型的正式構建 （1）確定攻毒方法：在預試驗的基礎上，根據不同日齡、不同感染方法所表現(xiàn)的結果，確定正式的模型構建方法：130日齡SPF青年蛋雞，共8只，每只雞先滴鼻H9N2 AIV液0.5 mL，所有雞滴完后，再滴IBV M41株液0.5 mL，滴完后再每只雞滴鼻大腸桿菌液0.5 mL。

（2）臨床癥狀及病理變化觀察：攻毒后，每天觀察雞群臨床癥狀及死亡情況，并做好記錄。

（3）稱重：試驗開始和結束時，每只雞稱重，計算增重率。

（4）體溫測定：攻毒后24 h開始，每天用體溫計測量體溫。

（5）抗體測定：試驗結束時，每只雞采血，分離血清，采用微量凝集法[8]測定H9N2 AIV抗體水平。

（6）排毒測定：攻毒后24 h開始，用棉拭子每只雞泄殖腔采集樣本，將采樣后的棉拭子放入2 mL離心管中，加入500 μL生理鹽水，在旋渦混合器上振蕩1 min，置冷凍離心機10 000 r/min離心5～10 min，取上清200 μL，TRIZol法提取RNA[9]。再用RT-PCR法檢測H9亞型AIV。根據公開發(fā)表的H9N2禽流感病毒全基因組序列，設計HA基因的擴增引物，其中上游引物P1：5，片段大小490 bp。RT-PCR按一步法進行，采用20 μL反應體系：2×one step Mix 10 μL，one step Enzyme mix 1 μL，引物P1（10 μmol/L）0.5 μL，引物P2（10 μmol/L）0.5 μL，模板RNA 3 μL， Rnase free ddH2O 補至20 μL。反應程序：50℃反轉錄30 min;94℃ 預變性3 min;

94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行30個循環(huán);72℃終延伸5 min。RT-PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[10]。

2 結果與分析

2.1 雛雞預試驗結果

試驗結果（表1）表明，雛雞同時肌注H9N2 AIV和大腸桿菌，比單獨肌注H9N2 AIV或大腸桿菌時臨床癥狀更嚴重;單獨接種H9N2 AIV，雛雞不表現(xiàn)任何癥狀。H9N2 AIV肌肉注射或滴鼻，雛雞表現(xiàn)無明顯差異。

2.2 青年蛋雞預試驗結果

各試驗組均有發(fā)病癥狀，但均無死亡。單獨感染H9N2 AIV時癥狀輕微，混合感染IBV或大腸桿菌時，癥狀明顯加重。三種病原同時混合感染時，癥狀最為嚴重，剖檢后病理變化最為明顯（表2）。表明，采用130日齡SPF青年蛋雞攻毒，與雛雞相比，發(fā)病癥狀更加典型;H9N2 AIV與IBV、大腸桿菌同時混合感染，癥狀及病變更為典型，更適合發(fā)病模型的構建。

2.3 人工感染模型正式試驗的構建結果

2.3.1 臨床癥狀及病理變化攻毒后48 h內，雞群無任何異常。48 h后，出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，禽流感癥狀典型，病雞出現(xiàn)“呼嚕呼?！钡臐裥詥簦械碾u出現(xiàn)尖叫聲，許多雞縮頭、乍毛、精神不振。攻毒后第3天死亡1只。

病雞剖檢：最典型的變化，卵泡充血、出血、壞死、液化，輸卵管內有大量膿性或干酪樣分泌物，腺胃乳頭或乳頭間有輕微出血，盲腸扁桃體腫脹出血，個別雞心臟出血，氣管輕微充血。

2.3.2 體重變化攻毒后第10天與攻毒前相比，體重明顯下降（表3）。

2.3.3 體溫情況試驗雞攻毒前測定正常體溫為41.2℃，攻毒后均出現(xiàn)了發(fā)熱癥狀（表4）。

2.3.4 抗體測定結果 攻毒后第11天試驗結束時每只雞采血，測定H9N2 AIV抗體水平，平均HI抗體滴度為7.5。

2.3.5 排毒測定結果攻毒后從第2天至第6天，均可從泄殖腔拭子中檢測到目的條帶，尤其是3～5天時陽性率最高，表明攻毒后試驗雞具有排毒現(xiàn)象。攻毒后不同天數，雞群陽性率情況見表5，第4天的PCR檢測結果見圖1。

3 討論與結論

3.1 為了構建H9亞型禽流感人工發(fā)病模型，對不同日齡SPF雞、不同攻毒劑量、不同感染途徑、不同混合感染方式進行了試驗篩選，最終確定了最佳的模型構建方法：選用130日齡新開產的SPF青年蛋雞，采用H9N2亞型AIV與IBV M41株、大腸桿菌強毒株混合感染，每只雞各滴鼻0.5 mL。在此條件下，感染雞表現(xiàn)出了明顯的發(fā)熱、精神萎靡、咳喘癥狀，剖檢病雞具有H9N2亞型禽流感的特征病變，攻毒后11天HI抗體滴度達7.5，感染后3天泄殖腔拭子H9N2 AIV RT-PCR檢測陽性率達87.5%。表明，本方法構建的H9亞型禽流感人工感染發(fā)病模型，具有發(fā)病癥狀明顯、病變典型、發(fā)病率高、死亡率適宜、穩(wěn)定可靠的特點，這為進一步開展禽流感藥物防治研究奠定了重要的基礎。

3.2 疾病動物模型是醫(yī)學研究和醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展不可或缺的支撐條件，缺乏合適的動物疾病模型已成為疫病機理研究、藥物篩選評價、疫苗開發(fā)的重要瓶頸[11-13]。構建科學穩(wěn)定的動物發(fā)病模型是藥效評價的基礎，往往是新獸藥研發(fā)中開展實驗性臨床試驗的難點，在新獸藥研發(fā)中具有重要作用[14]。動物試驗因為受到毒株毒力、攻毒劑量、外界環(huán)境、家禽日齡、家禽自身抵抗力等多種因素的影響，需要大量試驗尋求最佳的動物感染模型，并保證很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，才能對藥效做出客觀的評價[15，16]。本方法構建的禽流感發(fā)病模型發(fā)病癥狀明顯、病雞死亡率不高，對加快研發(fā)新型禽流感防治藥物具有重要意義。

3.3 在獸醫(yī)臨床上，雞群中H9亞型禽流感自然發(fā)病時，常常與大腸桿菌、IBV、支原體等發(fā)生混合感染[17，18]，從而對養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。本試驗發(fā)病模型的構建，采用了混合感染的方法，更加符合雞群自然發(fā)病的特點。

3.4 從日齡來看，青年蛋雞攻毒后發(fā)病癥狀和剖檢變化比雛雞更具有特征性，尤其是蛋雞卵巢與輸卵管的病變更具特征性，因而選擇青年蛋雞進行發(fā)病模型構建更為理想。

3.5 以前我們曾經單獨用大腸桿菌強毒株，采用滴鼻法，進行過SPF雞攻毒試驗，結果雞只無任何臨床癥狀，因而本次試驗未再設置單純大腸桿菌滴鼻對照組。我們也曾進行過單獨IBV攻毒試驗，采用120日齡SPF雞，單獨用IBV M41株每只0.5 mL滴鼻，48 h后感染雞僅出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，剖檢腺胃、肌胃、腸道、心臟、卵巢、輸卵管等內臟器官均無明顯出血病變。因此，本次試驗沒有另設IBV單一攻毒對照組。

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