植物響應(yīng)低溫脅迫組學(xué)研究進(jìn)展

楊慧菊　蘭玉倩　王石華

摘要：低溫是限制植物生長和分布的主要逆境因子之一。植物遭受低溫脅迫時(shí)會(huì)迅速啟動(dòng)相關(guān)基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，合成相應(yīng)蛋白質(zhì)，進(jìn)而控制代謝物的合成。為了抵御和適應(yīng)低溫環(huán)境，植物形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)迅速發(fā)展，組學(xué)已經(jīng)成為植物響應(yīng)逆境脅迫機(jī)理研究的重要方法，如基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組。這些組學(xué)研究技術(shù)相結(jié)合，能夠?yàn)樘骄恐参镯憫?yīng)低溫脅迫的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供有力手段。本文綜述轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組等組學(xué)技術(shù)用于分析植物應(yīng)答低溫脅迫的研究進(jìn)展，以期為揭示植物耐寒機(jī)理及優(yōu)良耐寒植物的篩選與培育提供參考。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫;轉(zhuǎn)錄組學(xué);蛋白質(zhì)組學(xué);代謝組學(xué)

中圖分類號(hào)：S184：Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）05-0142-07

Abstract Low temperature is one of the major stress factors affecting growth and distribution of plants. The expression of related gene would be activated rapidly for transcriptional regulation，and then the corresponding proteins could be synthesized to control metabolite synthesis when plants under low temperature stress. The plants have formed a complex regulatory network to resist and adapt to the low temperature environment. With the rapid development of molecular biology， omics， including genomics， transcriptomics， proteomics and metabolomics have become the frequently used approaches to study the response mechanisms to stress in plants. The combination of these omics could provide powerful tools for gene regulation network exploration of plants in response to low temperature stress. In this paper， we mainly summarized the methods and application of transcriptomics， proteomics and metabolomics under low temperature， which would be helpful for understanding mechanisms of plant cold tolerance.

Keywords Low temperature stress; Transcriptomics; Proteomics; Metabolomics

溫度是植物生長發(fā)育過程中的重要環(huán)境因子之一，只有在適宜溫度條件下植物體才能正常進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和能量交換。低溫不僅會(huì)限制植物生長發(fā)育，還會(huì)影響其種類分布;農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，低溫會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。近幾年，氣溫變化異常，極端天氣頻繁出現(xiàn)，低溫凍害也日趨嚴(yán)重。低溫已成為限制植物栽培和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)較為嚴(yán)峻的問題之一[1，2]。通過了解植物響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制，挖掘抗寒基因，再應(yīng)用基因工程改良植物抗寒性，進(jìn)而減少低溫對(duì)植物造成的損傷。

植物響應(yīng)低溫脅迫是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，涉及到基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和代謝水平。隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，已被廣泛應(yīng)用到植物響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)研究中，為抗逆基因鑒定及標(biāo)志性代謝物的挖掘提供了有力手段。近幾年，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)系統(tǒng)全面地解析生物分子功能和調(diào)控機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn)[3]。因此，本文對(duì)近年來植物響應(yīng)低溫脅迫的組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為植物應(yīng)答低溫脅迫研究的未來發(fā)展提供參考。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是一門從 RNA 水平研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，通過對(duì)某一特定生理?xiàng)l件下植物體內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄本的 RNA 序列進(jìn)行測(cè)序，揭示逆境脅迫下整個(gè)基因組水平的表達(dá)情況，是進(jìn)行基因功能研究的一個(gè)重要手段。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)主要包括兩大類：基于雜交技術(shù)的cDNA芯片技術(shù)、寡聚核苷酸芯片技術(shù)和基于測(cè)序技術(shù)的表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（EST）、基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE）、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（MPSS）、RNA測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）。其中基于雜交的芯片技術(shù)，對(duì)低豐度基因及無參考基因組植物的研究存在限制問題，且靈敏度較低。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基于測(cè)序的RNA-Seq技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中[4，5]。

轉(zhuǎn)錄組水平的研究，是反映植物在某一特定生長發(fā)育階段或生理?xiàng)l件下細(xì)胞、組織或器官所有基因的表達(dá)情況，具有一定的動(dòng)態(tài)性，能夠更加全面地揭示植物在低溫脅迫下基因的轉(zhuǎn)錄情況及調(diào)控關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)已應(yīng)用于多種植物響應(yīng)逆境脅迫的研究中，包括干旱、鹽、金屬、溫度等非生物脅迫和病原菌、病蟲害等生物脅迫[6]。目前，已利用基因芯片技術(shù)對(duì)擬南芥和水稻等模式植物在非生物脅迫下的基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析[7，8];運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)已在全基因組水平上對(duì)玉米苗期響應(yīng)鹽、干旱、高溫和低溫逆境的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，共鑒定到5 530個(gè)差異表達(dá)基因，它們主要與激素代謝、信號(hào)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子、脂肪酸的生物合成以及脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[9]。

近幾年，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已被廣泛應(yīng)用到果樹、大田作物、林木、蔬菜等響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)研究中。如：利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行野生蕉低溫響應(yīng)的全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR359、miR408、miR172等會(huì)特異響應(yīng)寒害和凍害脅迫，表明這些miRNAs很可能在野生蕉響應(yīng)低溫脅迫過程中起著重要作用;差異表達(dá)lncRNAs靶基因顯著富集于糖酵解、可變剪接體、碳代謝和生物素代謝途徑中[10]。對(duì)3℃低溫處理12 h的枇杷幼果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)枇杷響應(yīng)低溫脅迫過程中有多個(gè)參與調(diào)控油菜素甾醇生物合成和磷脂酸肌醇信號(hào)系統(tǒng)的差異基因上調(diào)表達(dá)，表明油菜素甾醇生物合成和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)在枇杷低溫抗性中發(fā)揮重要作用[11]。火龍果實(shí)生苗在-2℃脅迫下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因多于低溫抑制的基因數(shù)目，且這些誘導(dǎo)表達(dá)的基因主要存在于光合作用通路和代謝通路中，表明低溫脅迫可能對(duì)火龍果的光合作用以及物質(zhì)代謝產(chǎn)生了較大影響[12]。

在農(nóng)作物響應(yīng)逆境脅迫的研究中，對(duì)低溫和常溫處理的兩個(gè)甘蔗品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種的共有差異表達(dá)基因顯著富集于逆境反應(yīng)、膜系統(tǒng)、光合作用;品種間的差異表現(xiàn)為，抗寒性較強(qiáng)的品種其葉綠體膜結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、光合能力較高，其細(xì)胞膜穩(wěn)定性也有差異，因此兩個(gè)甘蔗品種的差異表達(dá)基因分別富集于不同的通路，即桂糖 08-1180在 DNA 整合、RNA 聚合酶、ADP 結(jié)合及代謝酶中富集較多，而ROC22顯著富集在有機(jī)化合物的合成、運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性[13]。孟玉等[14]也對(duì)4℃低溫脅迫不同時(shí)長后的蔗茅野生種進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同處理時(shí)間下的樣本，差異表達(dá)基因共同富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原體互作、光合作用、淀粉和蔗糖代謝以及苯丙烷生物合成等途徑中。利用 RNA-Seq 技術(shù)，對(duì)4℃低溫馴化28天和-5℃低溫處理24 h后的小麥幼苗莖基部基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和冷誘導(dǎo)蛋白相關(guān)的共有差異基因，這些基因主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和糖代謝以及次級(jí)代謝物合成等途徑[15]。為了明確低溫應(yīng)答對(duì)水稻苗期生長發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)17℃低溫處理下的粳稻品種中花-11進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，主要分析了光合作用通路和苯丙氨酸代謝通路中差異基因表達(dá)情況及新基因功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)低溫主要影響其光合作用、次生代謝的生物合成以及苯丙氨酸代謝;新基因預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子WRKY115和WRKY117，表明水稻幼苗響應(yīng)低溫過程中發(fā)生了顯著變化[16]。將不同抗凍性的玉米自交系在-1℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行1、3 h和5 h的低溫處理，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)抗凍自交系和凍害敏感自交系中存在4 550個(gè)基因在4個(gè)不同處理中差異性表達(dá)，其中有360個(gè)基因在抗凍自交系中特異性表達(dá);這些特異性表達(dá)的基因主要參與了低溫響應(yīng)、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)等;此外，泛素連接酶復(fù)合體也顯著富集[17]。李萌[18]也對(duì)4℃低溫處理0、4、24 h的抗低溫自交系M54和不抗低溫自交系753F葉片進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)M54和753F中各有3 970個(gè)和1 766個(gè)基因呈現(xiàn)差異表達(dá);通過KEGG注釋，發(fā)現(xiàn)與抗低溫相關(guān)的苯丙烷途徑、苯丙氨酸代謝途徑、淀粉和糖代謝途徑、碳代謝途徑等通路在兩個(gè)自交系中均呈現(xiàn)差異表達(dá)基因富集，表明次生物質(zhì)代謝及碳水化物代謝在玉米抗低溫過程中發(fā)揮重要作用。利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，對(duì)-2℃低溫脅迫處理后的馬鈴薯進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)受低溫脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)的基因主要參與信號(hào)生物代謝、氧化還原、能量代謝、次生代謝等過程[19]。

近年來有關(guān)木本植物響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也取得較快進(jìn)展。Chen等[20]采用Solexa 測(cè)序技術(shù)完成了胡楊苗木響應(yīng)低溫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集于轉(zhuǎn)錄因子和與ABA、鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄成分;對(duì)彎刺薔薇低溫馴化響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)枝條中差異表達(dá)和差異上調(diào)表達(dá)基因均多于葉片，但其差異表達(dá)基因的KEGG 代謝通路均富集于植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝和植物病原菌互作上[21]。

此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也廣泛運(yùn)用于蔬菜作物響應(yīng)低溫的研究中。對(duì)4℃低溫脅迫0、2、6、12 h和24 h的甘藍(lán)型油菜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)大量與生物調(diào)控、免疫過程、代謝過程和應(yīng)激響應(yīng)等相關(guān)的差異功能基因，這些基因多數(shù)顯著富集在植物晝夜節(jié)律、植物-病原菌互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝物生物合成等通路中[22]。利用TOM2芯片分析了4℃低溫脅迫3 d的抗/感番茄幼苗基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與光合作用相關(guān)的基因在抗感材料中均被抑制，且茉莉酸生物合成、油菜素內(nèi)酯代謝過程、苯丙素生物合成、淀粉降解等代謝途徑在抗感材料間均發(fā)生顯著變化[23]。采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)獨(dú)行菜低溫萌發(fā)停滯前后的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得2 108個(gè)差異表達(dá)基因，它們主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核糖代謝、萜類化合物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[24]。

由于植物對(duì)低溫的耐受性不同、低溫脅迫程度不同，植物體會(huì)表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。通過對(duì)低溫下植物轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，能夠得到許多植物響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過對(duì)這些差異基因進(jìn)行注釋和功能分類，發(fā)現(xiàn)它們主要參與一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、物質(zhì)合成和代謝途徑。這些差異基因的表達(dá)模式，為抗寒性基因功能研究提供了許多候選基因，也為進(jìn)一步研究植物抗寒性分子機(jī)制以及抗寒品種選育奠定基礎(chǔ)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的基本物質(zhì)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)組（proteome）是指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)，包括對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究和蛋白質(zhì)組功能模式的研究，主要涉及蛋白質(zhì)的分離、鑒定和生物信息學(xué)分析等技術(shù)。蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE）;蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定主要有質(zhì)譜技術(shù)（mass-spectrometric technique）和多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（multidimensional protein identification technology，MudPIT）;蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析主要有免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）、酵母雙雜交（yeast two-hybrid）、蛋白質(zhì)芯片（protein chip）、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）以及非標(biāo)記定量（label-free）等。分離鑒定得到的蛋白質(zhì)通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)和生物信息學(xué)分析進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，目前常見的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫有Swiss-PROT、SMART、PDB、HSSP、EMBL、CITH、NCBI等[25]。用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，可以分析植物生長發(fā)育中不同階段、不同組織在特異條件下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)模式，篩選出差異表達(dá)的蛋白，進(jìn)行功能驗(yàn)證，已廣泛應(yīng)用于植物響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制的研究中[26]。如應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)分析水稻、油菜、大豆、菠菜、棉花等在干旱、高溫、低溫、鹽、重金屬等非生物脅迫和病蟲害等生物脅迫下的差異蛋白表達(dá)模式，為揭示其逆境應(yīng)答機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為抗逆品種的培育和遺傳改良提供了重要理論依據(jù)[27-31]。

低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)大量基因的表達(dá)，產(chǎn)生冷脅迫響應(yīng)蛋白，探究低溫環(huán)境下的蛋白表達(dá)譜，能動(dòng)態(tài)性地反映植物細(xì)胞和組織在特定條件下所處狀態(tài)。在植物響應(yīng)低溫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，分析較多的有擬南芥、鹽芥、水稻、小麥、玉米等。如：運(yùn)用雙向熒光差異凝膠電泳和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析低溫脅迫下擬南芥亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組早期變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要參與淀粉降解、三羧酸循環(huán)和蔗糖代謝途徑[32];Gao 等[33]運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同時(shí)長（6 h及2、5、24 d）低溫脅迫后的鹽芥進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析，表明低溫脅迫蛋白主要參與光合作用、RNA 新陳代謝、能量代謝和細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)等，且隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，差異蛋白表達(dá)越多。利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析水稻葉片響應(yīng)不同程度低溫的蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化特征，共在水稻葉片中鑒定到504種低溫響應(yīng)蛋白質(zhì)，其中特異表達(dá)蛋白主要涉及光合作用中的葉綠素a/b結(jié)合蛋白、光系統(tǒng)Ⅱ作用中心P680葉綠素a載脂蛋白、放氧復(fù)合體蛋白、糖酵解中的相關(guān)酶、氧化平衡系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶、過氧化物酶以及低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的小G蛋白、鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、14-3-3蛋白等，這些特異表達(dá)蛋白為深入研究水稻低溫應(yīng)答的分子機(jī)理提供了重要證據(jù)[34-36]。小麥多屬于耐寒性作物，但長時(shí)間零下低溫也會(huì)對(duì)其生長造成損傷。Han等[37]對(duì)-5℃低溫脅迫1 d和 3 d的小麥葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶和LEA 等與脅迫應(yīng)激/防御相關(guān)的蛋白，在小麥適應(yīng)低溫脅迫過程中特異性表達(dá);霍望[38]也采用2-DE及質(zhì)譜技術(shù)對(duì)耐寒型和低溫敏感型小麥-5℃低溫脅迫72 h后進(jìn)行全蛋白分析，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸過氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸核酮糖激酶等分別參與了低溫脅迫下的氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)代謝、光合作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在小麥響應(yīng)低溫逆境中發(fā)揮了重要作用。利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究低溫脅迫前后玉米葉片蛋白質(zhì)表達(dá)情況，共鑒定到173個(gè)差異豐度蛋白，功能性分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要在緩解光損傷、通過糖酵解產(chǎn)生更多能量、提高清除ROS的能力以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和翻譯后修飾等過程中發(fā)揮作用[39]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)除了應(yīng)用于研究不同低溫敏感植物組織和器官對(duì)低溫逆境的響應(yīng)，在低溫貯藏研究中也應(yīng)用較多。Yun等[40]研究4℃下不同貯藏期的柑橘時(shí)發(fā)現(xiàn)，有56個(gè)差異蛋白主要參與糖代謝和氨基酸代謝。Yang等[41]運(yùn)用穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)、反向液相色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)5℃低溫下貯藏5個(gè)月的馬鈴薯進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，共檢測(cè)到4 463個(gè)蛋白點(diǎn)，其中46個(gè)差異蛋白點(diǎn)主要與控制淀粉糖的轉(zhuǎn)化相關(guān)。

植物耐寒性受多基因網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控，生長過程中各種信號(hào)傳導(dǎo)及代謝網(wǎng)絡(luò)相互交錯(cuò)關(guān)聯(lián)。采用多種蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合方法，獲得低溫脅迫下植物特異蛋白變化及蛋白互作數(shù)據(jù)，可為揭示植物低溫脅迫下蛋白質(zhì)組整體耐寒機(jī)制提供依據(jù)。

3 代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)（metabolomics 或 metabonomics）是指對(duì)限定條件下的特定生物體或細(xì)胞中全部低分子（相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000）代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新興的一門交叉學(xué)科[42]。植物代謝組學(xué)主要研究不同物種、不同基因類型或生態(tài)類型的植物在特定生長條件下所有小分子代謝產(chǎn)物在種類、數(shù)量上的變化規(guī)律[43]。代謝產(chǎn)物是基因轉(zhuǎn)錄與蛋白修飾的最終產(chǎn)物，通過分析逆境條件下植物體代謝產(chǎn)物的變化，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一些未知基因或蛋白的功能，為揭示植物逆境響應(yīng)機(jī)制提供更多依據(jù)。植物代謝產(chǎn)物大體分為初生代謝物和次生代謝物兩大類，與響應(yīng)逆境相關(guān)的大多數(shù)為次生代謝物[44]，因此，代謝組學(xué)方法運(yùn)用于研究植物響應(yīng)逆境機(jī)制越來越受到研究者的青睞。

由于代謝組學(xué)分析對(duì)象的物理化學(xué)性質(zhì)差異很大，植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物種類繁多，且理化性質(zhì)不同，單一檢測(cè)方法不能檢測(cè)出所有代謝物，因此，代謝組學(xué)研究中常采用多種分離、檢測(cè)方法相結(jié)合方法，以獲得較為全面的代謝物組分。代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)主要有：氣相色譜（GC）、液相色譜（LC）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）。實(shí)際研究中一般采用聯(lián)用技術(shù)：氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）和高效液相色譜和核磁聯(lián)用技術(shù)（HPLC-NMR）等，目前色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振技術(shù)應(yīng)用較為廣泛。

代謝產(chǎn)物是生物體在不同生理生態(tài)條件下代謝水平的體現(xiàn)，植物處于高溫、低溫、干旱、鹽、病原菌以及重金屬等脅迫下都會(huì)在分子、細(xì)胞以及生理水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，產(chǎn)生大量代謝物。在擬南芥低溫脅迫研究中，Cook等[45]采用GC-TOF-MS 聯(lián)合技術(shù)對(duì)低溫下不同抗寒性擬南芥進(jìn)行了代謝組分析，共檢測(cè)出434種代謝產(chǎn)物，其中325種代謝物在響應(yīng)低溫過程中增加;Kaplan等[46]也通過GC-MS技術(shù)對(duì)低溫脅迫下的擬南芥進(jìn)行代謝組分析，發(fā)現(xiàn)在響應(yīng)低溫過程中植株體內(nèi)的天冬氨酸、鳥氨酸、精氨酸含量增加。巴爾干苣苔是一種抗性很強(qiáng)的物種，為揭示其低溫響應(yīng)過程中的代謝組分變化，Benina等[47]利用 GC-MS 技術(shù)分別對(duì)4℃低溫處理下的巴爾干苣苔、鹽芥和擬南芥代謝水平進(jìn)行了對(duì)比分析。其結(jié)果表明低溫下巴爾干苣苔所產(chǎn)生的代謝物種類最多，主要是糖類、檸檬酸鹽、甘油;擬南芥中腐胺和延胡索酸鹽等有機(jī)酸較多;鹽芥中則氨基酸類物質(zhì)較多，三個(gè)物種在代謝水平上對(duì)低溫作出了不同的響應(yīng)。利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)4℃低溫馴化和-5℃冷凍處理的小麥幼苗進(jìn)行代謝譜分析，發(fā)現(xiàn)4℃低溫馴化后共有86個(gè)代謝物上調(diào)、137個(gè)下調(diào)，這些代謝物主要包括糖類、黃酮類、有機(jī)酸和植物激素等，它們主要參與精氨酸和脯氨酸代謝、半乳糖代謝以及植物次級(jí)代謝物合成等代謝通路;-5℃冷凍處理后，共檢測(cè)到8個(gè)差異代謝物，主要包括脫落酸、茉莉酸-異亮氨酸等[48]。為探究不同品種玉蘭低溫脅迫下的代謝表型差異，采用GC-MS 技術(shù)對(duì)紅花玉蘭和白玉蘭莖尖進(jìn)行代謝組分析，發(fā)現(xiàn)4℃低溫脅迫下紅花玉蘭主要積累氨基酸類和糖類代謝物，白玉蘭僅積累氨基酸類代謝物[49]。Morsy等[50]采用HPLC技術(shù)對(duì)抗寒性不同的兩個(gè)水稻品種進(jìn)行低溫脅迫下的代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诘蜏孛{迫下可溶性糖類積累差異較大，且抗寒性較強(qiáng)的品種半乳糖和棉子糖積累增加，而低溫敏感型水稻則積累減少。

植物在低溫下會(huì)積累許多代謝產(chǎn)物，在代謝水平上響應(yīng)溫度脅迫。目前發(fā)現(xiàn)與植物響應(yīng)低溫相關(guān)的代謝物主要有糖類、氨基酸、有機(jī)酸、硫代謝物和三羧酸循環(huán)中間代謝物，對(duì)這些代謝產(chǎn)物進(jìn)行功能分類和鑒定，進(jìn)而確定其在植物低溫脅迫下的代謝調(diào)控規(guī)律，即可從代謝水平上對(duì)低溫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行分析。

4 展望

植物在低溫條件下會(huì)在基因、蛋白、代謝物等不同層次作出響應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的差異表達(dá)基因、差異表達(dá)蛋白和特異性代謝產(chǎn)物。低溫脅迫條件下，植物感受低溫刺激后首先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，啟動(dòng)與低溫脅迫相關(guān)基因，合成應(yīng)激蛋白，進(jìn)而控制相關(guān)代謝物的合成。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分別從RNA水平、蛋白質(zhì)水平和代謝物水平揭示低溫脅迫下植物在不同層次發(fā)生的變化，有助于挖掘與低溫相關(guān)的新基因、新蛋白以及特異性代謝產(chǎn)物等，通過對(duì)這些基因、蛋白質(zhì)和代謝物進(jìn)行功能分析和鑒定，來為植物抗寒性基因工程和抗寒性植物品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。

當(dāng)前對(duì)于植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究主要集中于單一組學(xué)或兩個(gè)組學(xué)聯(lián)合分析，只能在單一水平上反映低溫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA 水平上研究低溫下轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，蛋白質(zhì)組學(xué)是研究轉(zhuǎn)錄后翻譯得到的蛋白質(zhì)變化規(guī)律，而代謝組學(xué)研究的是植物響應(yīng)低溫最終的體現(xiàn)形式，即代謝產(chǎn)物，三個(gè)“組學(xué)”技術(shù)從不同層次揭示植物低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制。植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制研究中，大多數(shù)采用一種“組學(xué)”或兩種“組學(xué)”進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。然而低溫條件下植物體內(nèi)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑是錯(cuò)綜復(fù)雜的，單一“組學(xué)”的研究難以全面揭示植物在低溫脅迫下的整個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此今后的相關(guān)研究中，需要將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組等關(guān)聯(lián)起來，結(jié)合差異基因功能分析、差異蛋白生物信息分析、差異代謝物生物信息分析和分子互作等，系統(tǒng)全面地解析植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制。

植物對(duì)低溫的抗性和適應(yīng)性是植物器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞等多方面共同作用的結(jié)果，且同種植物的不同品種對(duì)相同條件的低溫脅迫都可能存在不同的抗性調(diào)節(jié)機(jī)制。在今后的相關(guān)研究中，還需要對(duì)植物的不同器官或組織，采用多個(gè)“組學(xué)”相結(jié)合的方法進(jìn)行深入探究，加強(qiáng)對(duì)低溫條件下一些重要調(diào)控途徑、特異功能蛋白和關(guān)鍵基因的挖掘，將有助于深入了解植物的抗寒機(jī)制，也可為進(jìn)一步培育植物抗寒新品種提供更廣泛的基因資源。

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