基于體細胞突變數(shù)據(jù)庫篩選免疫原性結(jié)直腸癌高頻新抗原的方法

秦麗麗，李毅堅，梁兆端，陳蕾，李文慧，陳超,3,4，黃亞靈，張樂,3,4，劉松明,3,4，邱思,4，葛玉萍，彭文婷,3，林欣欣,4，張秀清,4，董旋，李波,4

技術(shù)與方法

基于體細胞突變數(shù)據(jù)庫篩選免疫原性結(jié)直腸癌高頻新抗原的方法

秦麗麗1,2，李毅堅1，梁兆端1，陳蕾1，李文慧1，陳超1,3,4，黃亞靈1，張樂1,3,4，劉松明1,3,4，邱思1,4，葛玉萍1，彭文婷1,3，林欣欣1,4，張秀清1,4，董旋1，李波1,4

1. 深圳華大生命科學研究院，深圳 518083 2. 大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，大理 671000 3. 中國科學院大學華大教育中心，深圳 518083 4. 武漢華大吉諾因生物科技有限公司，武漢 430079

結(jié)直腸癌是世界高發(fā)和高致死率的惡性腫瘤。靶向新抗原的免疫治療已被證實可以誘導癌癥患者腫瘤持續(xù)消退，但這些特異性新抗原，僅適用于個體精準治療。隨著大量的高頻腫瘤基因突變被發(fā)現(xiàn)，這些與突變相關(guān)的高頻新抗原可覆蓋更多人群，具有較強的臨床意義。然而目前結(jié)直腸癌中是否也存在高頻新抗原仍不清楚。本研究利用來源于321個結(jié)直腸癌患者的體細胞突變數(shù)據(jù)庫，聯(lián)合1種標準過濾和7種預測算法，篩選并獲得了25個基于中國人高頻分型HLA-A*1101限制性的高頻新抗原，它們均具有高親和力(IC50<50 nmol/L)和高呈遞分值(>0.90)；其中，除了陽性對照多肽KRAS_G12V8-16外，11個高頻新抗原能夠在體外誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)分泌γ干擾素(interferon gamma, IFN-γ)，證實具有免疫原性。選取免疫原性最強的新抗原C1orf170_S418G413-421及陽性對照多肽KRAS_G12V8-16體外刺激T細胞，利用流式細胞分選及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲得其特異性CTL的免疫組庫信息，所構(gòu)建的TCR-T（T-cell receptor engineered T cell）能夠識別新抗原并分泌細胞因子。以上結(jié)果表明，本研究開發(fā)了一種利用體細胞數(shù)據(jù)庫預測并體外篩選驗證具有免疫原性高頻新抗原的方法，為結(jié)直腸癌及其他癌種的多肽、DC（dendritic cells）疫苗、TCR-like抗體、TCR-T等免疫治療提供了重要的多肽靶點和TCR信息，具有實際的臨床應用價值。

結(jié)直腸癌；高頻；新抗原；呈遞

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是目前全球范圍內(nèi)第2致死和第3高發(fā)的惡性腫瘤[1]。傳統(tǒng)的外科手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等方法，均不能有效提升患者的5年生存率[2]。近年來，免疫治療作為新興有效的腫瘤免疫療法，已經(jīng)被廣泛應用在結(jié)直腸癌的治療中[3]。過表達親和力增強的T細胞受體(T-cell receptor，TCR)或者基于抗體的人工嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)工程化改造T細胞，使其靶向腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens, TAAs)，如癌胚抗原CEA[4,5]和人表皮生長因子HER2[6]，雖然能夠抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，但也會導致患者產(chǎn)生嚴重的自身性免疫反應。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性新抗原，對于提高結(jié)直腸癌過繼性T細胞療法的有效性和安全性具有重要價值。

腫瘤特異性抗原(tumor-specific antigens, TSAs)由腫瘤細胞蛋白編碼區(qū)的體細胞突變產(chǎn)生，與在正常細胞中低表達但在腫瘤細胞中高表達的TAAs相比[4~6]，僅存在于腫瘤細胞中[7]。在腫瘤中，累積的突變包括非同義、無義、插入/刪除(InDel)和移碼，又可分為驅(qū)動突變(driver mutations)和乘客突變(passage mutations)，前者多與細胞生長失控和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，后者不影響致瘤表型但會增加免疫原性[8]。突變的新抗原多肽由主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex, MHC)分子呈遞到腫瘤細胞表面，然后被T細胞識別，從而導致強烈的抗腫瘤作用[9]。高度特異的新抗原可實現(xiàn)個性化的癌癥免疫療法，但限制了其廣譜性的使用范圍[10]。數(shù)據(jù)顯示，一些腫瘤由于微衛(wèi)星不穩(wěn)定而導致高腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)進而常會產(chǎn)生一些高頻的新抗原[10]。在結(jié)直腸癌患者中，約15%~20%的患者具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定，并且結(jié)直腸癌的缺陷錯配修復(deficient mismatch repair, dMMR)具有遠高于標準值的TMB[3]，預示結(jié)直腸癌可產(chǎn)生大量高頻新抗原。此外在兩種類型的突變中，驅(qū)動突變僅占有8%的CD8+T細胞新表位，而乘客突變則產(chǎn)生92%的CD8+T細胞新表位和100% CD4+T細胞新表位[8]。同時，在遞呈多肽的HLA分子中，HLA-A*1101等位基因是美國白種人、亞裔美國人和中國人[11]高頻分型(http://www.allelefrequencies.net/)。因此，找到靶向兩種類型突變并受HLA-A*1101限制的高頻新抗原，不但可以提高結(jié)直腸癌免疫療法的療效、安全性和適用率，還可以降低結(jié)直腸癌臨床治療的成本和時間，具有重要的臨床實際意義。本研究建立了一套分析與驗證的方法，從321例結(jié)直腸癌患者的體細胞突變數(shù)據(jù)中預測了HLA-A* 1101限制的高頻新抗原，并驗證了它們的免疫原性，為結(jié)直腸癌免疫治療的提供了新的靶點，具有較強的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白(transporters associated with antigen processing, TAP)缺陷的T2細胞系(CRL-1992)和HEK-293細胞系(CRL-1573)均購自美國ATCC中心。采用含10%Hyclone胎牛血清(Healthcare公司，美國)的Gibco IMDM培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司，美國)培養(yǎng)T2細胞，以及含10%胎牛血清的Gibco DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司, 美國)培養(yǎng)HEK293細胞。過表達HLA-A*1101分子的慢病毒感染T2細胞系后，對細胞進行HLA分型鑒定，確認獲得HLA-A*1101分型的T2細胞系。采集已簽署知情同意書的健康自愿者的外周血，通過Ficoll-Hypaque梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，并在10%胎牛血清的T009培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該研究由華大(深圳)倫理審查委員會(編號：BGI-IRB18142)批準。

1.2 突變選擇和表位預測

從國際癌癥基因組協(xié)會(ICGC)數(shù)據(jù)庫(http:// icgc.org)中下載中國大腸癌項目(COCA-CN, https:// icgc.org/icgc/cgp/73/371/1001733)的321名結(jié)直腸癌患者的體細胞突變數(shù)據(jù)進行分析。根據(jù)分析標準，過濾錯義突變，從突變位點中選取體細胞突變表位候選肽和野生型肽。再通過NetMHC-4.0[12]、NetMHCpan-3.0[13]、NetMHCpan-4.0[14]、PSSMHC-pan-1.0[15]、PickPocket-1.0[16]和SMM[17]分析候選抗原肽與HLA-A*1101分子之間親和力。檢測結(jié)果用IC50作為預測的平衡結(jié)合常數(shù)(50%抑制濃度，nmol/L)，其中IC50<50 nmol/L，表示強親和力，IC50介于50~500 nmol/L之間，則表示弱親和力[18]。此外，本研究還使用華大自主開發(fā)的Epitope Presen-tation Integrated Prediction(EPIP)軟件[19,20]，預測候選抗原肽的呈遞，預測結(jié)果以最高呈遞概率的分數(shù)來表示。選擇所預測具有強親和力和高呈遞效率的突變肽，作為候選新抗原。

1.3 制備成熟樹突狀細胞(mature dendritic cell, mDC)

預測的候選多肽與陽性對照肽KRAS G12V8-16(VVGAVGVGK)，均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，純度大于98%。根據(jù)文獻已報道方法制備mDCs[21]，即從健康自愿者分離PBMC，利用CD14 MicroBeads (Miltenyi Biotec公司，德國)，富集CD14+細胞，在添加2%人血清白蛋白(WAKO公司，日本)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(R&D Systems公司，美國)和IL-4(PeproTech公司，美國)的CellGenixTM DC培養(yǎng)基(CellGenix)中培養(yǎng)5 d。第6 d，添加TNF-α(R&D)、IL-6(PeproTech公司，美國)、IL-1β (R&D Systems公司，美國)、前列腺素E2 (Sigma- Aldrich公司，美國)和Poly(I:C)(InvivoGen公司，美國)，繼續(xù)培養(yǎng) 2 d，即為mDCs。收獲后，將mDCs與多肽(1 μg/mL)在37℃無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育4 h，作為抗原呈遞細胞。

1.4 誘導新抗原特異性CTLs

從健康自愿者分離PBMC后，用CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec公司，德國)富集CD8+T細胞，再用負載肽的mDC刺激CD8+T細胞(CD8+T：mDC，4∶1)，使用上海倍諳基公司的HIPP?-T009淋巴無血清培養(yǎng)基+10%胎牛血清(T009+10%胎牛血清)+ IL21(PeproTech公司，美國)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12 d。在共培養(yǎng)的第3 d，向培養(yǎng)基中添加IL-2 (PeproTech公司，美國)、IL-7 (PeproTech公司，美國)和IL-15 (PeproTech公司，美國)，每2~3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 d后，用相同負載多肽的mDC再次刺激CD8+T細胞，之后再共培養(yǎng)12 d，最后獲得新抗原特異性CTLs。

1.5 酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immuno-spot assay, ELISPOT)測定IFN-γ

使用Human IFN-gamma ELISpot PLUS kit (Mabtech公司，瑞典)試劑盒檢測IFN-γ的分泌。將2輪擴增后的CTL細胞更換至T009+10%胎牛血清培養(yǎng)基中，靜息培養(yǎng)24 h后，按比例與T2細胞(已負載10 μg/mL多肽/未負載多肽)混合，在預處理的ELISPOT板(Mabtech公司，瑞典)內(nèi)共培養(yǎng)24 h，每個樣品設置重復。按照操作說明檢測IFN-γ的分泌，用ELISPOT讀取器BioReader 4000 (BioSys公司，德國)對斑點成像并計數(shù)。根據(jù)特異性斑點的數(shù)量大于10且高于陰性對照組斑點數(shù)2倍以上，判斷為陽性反應[22]。

1.6 熒光激活細胞分選(fluorescence activated cell sorting, FACS)

收集細胞，用含有2%胎牛血清的PBS洗滌(FACS緩沖液)后重懸。利用文獻報道的方法制備獲得APC偶聯(lián)的pMHC四聚體(pMHC-tetramer- Allophycocyanin (APC)，簡稱pMHC-tetramer-APC)[23]以及購買的商品化PE熒光的抗CD8抗體(BD)、PE熒光的抗mouse-TCRβ抗體(BD)，對細胞進行染色，4℃避光45 min后，再用FACS緩沖液洗滌5次。使用FACS AriaⅡ(BD Biosciences公司，美國)流式儀對細胞進行分析，并對CD8+/pMHC四聚體+雙陽性T細胞進行分選，進行單細胞RNA測序。使用FlowJo軟件分析流式數(shù)據(jù)。

1.7 通過單細胞RNA測序分析新抗原特異性T細胞受體庫(TCR庫)

根據(jù)Chromium?單細胞V(D)J試劑盒(10x Genomics公司，美國)操作說明，將分選出的CD8+/ pMHC四聚體+雙陽性T細胞，通過Chromium?單細胞控制器捕獲并分配到乳液凝膠珠(gel bead in emulsion, GEM)中。單細胞和凝膠珠在GEM中裂解后，進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增，并將barcode標記在mRNA的Poly-A尾上。GEM斷裂后，將帶barcode的cDNA分子混合到一起，通過PCR擴增富集TCR cDNA的全長V(D)J片段，并進行Illumina?測序建庫。通過Cell Ranger?分析方法，分析TCR庫及配對的TCR。

1.8 構(gòu)建TCR-T細胞

將測序獲得的TCR的α鏈、β鏈的可變區(qū)分別與鼠源的恒定區(qū)融合，再用T2A序列將α鏈和β鏈進行連接，構(gòu)建進慢病毒表達載體pLVX (CMV- EF1a-ZsGreen-P2A-Bsd)中。如前所述，通過HEK-293細胞，包裝制備用于T細胞感染的慢病毒顆粒[24]。慢病毒感染已激活2 d的CD8+T細胞，之后在含10%胎牛血清、IL-2、IL-7和IL-15的T009培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d，即完成TCR-T制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變候選新抗原的預測

從ICGC數(shù)據(jù)庫下載COCA-CN項目中截止至2018年8月29日的321例結(jié)直腸癌患者體細胞突變數(shù)據(jù)，分析獲得3500個單核苷酸變異(single nucleotide variants, SNVs)，以及191個InDels突變，共3691個突變位點。每個突變選取突變位點及上游9個氨基酸和下游9個氨基酸，組成共19個氨基酸的突變表位。分析這些突變表位中9~10-mer含突變位點的候選新抗原與對照抗原，共獲得60,169個SNVs候選新抗原和6891個InDels候選新抗原。

利用NetMHC-4.0、NetMHCpan-3.0、NetMHCpan- 4.0、PSSMHCpan-1.0、PickPocket-1.0和SMM等軟件，預測候選新抗原與HLA-A*1101分子的結(jié)合親和力。一共篩選出56個候選新抗原，它們滿足至少3種軟件預測顯示親和力IC50均<50 nmol/L，選取3個軟件中最小的親和力預測值作為肽-MHC復合物的親和力預測值(表1)。此外，還使用了自主研發(fā)的HLA-I呈遞表位的預測軟件算法EPIP，評估預測了強結(jié)合親和力的56個突變表位的呈遞概率。在這56個突變表位中，有25個EPIP評分值超過0.90，表明其呈遞概率高，因此最終選擇這25個突變表位(來源于21個基因)作為候選新抗原(表1)。

2.2 檢測CTL體外分泌IFN-γ驗證新抗原的免疫原性

通?？梢詮哪[瘤浸潤淋巴細胞(TILs)、癌癥患者的外周記憶淋巴細胞、健康供體的外周幼稚淋巴細胞中檢測到靶向腫瘤新抗原的T細胞[11,25]。相比患者，健康供體來源的PBMC較容易獲得，用于鑒定預測新抗原的免疫原性。因此，本研究選擇抽取健康人志愿者的外周血，來驗證預測的新抗原能否刺激他們的CTL分泌IFN-γ，確認其是否具有免疫原性。用負載候選新抗原的mDC與未負載多肽的mDC，分別與體外PBMC分離的HLA-A*1101分型的CD8+T共培養(yǎng)兩輪，獲得新抗原特異性的CTL。將靜息后的CTL分別與負載對應新抗原的T2細胞共孵育，檢測INF-γ的分泌。

表1 預測的結(jié)直腸癌候選抗原肽列表

紅色粗體：突變位點；TSG：腫瘤抑制基因。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2細胞負載C1orf170_S418G413-421、KIAA1683_M313T311-319、SSX5_E19Q12-20、TMEM185B_ A42G42-51和UNC93A_M403T402-410等候選抗原肽，與陽性對照抗原肽KRAS_G12V8-16一樣，能顯著特異性刺激CTL產(chǎn)生IFN-γ，產(chǎn)生斑點數(shù)比陰性對照組多10倍(圖1，A和B)。另外，T2細胞負載GLCE_V533I526-535、CCRL2_F179Y174-183、ANKRD36C_ N1571S1571-1579、MUC3A_S326T319-327、ARHGEF11_ H1427R1427-1435和MUC6_P2049L2044-2053等抗原肽，也能特異性刺激CTL產(chǎn)生低水平的IFN-γ，比陰性對照多2倍，其余多肽刺激的斑點數(shù)與陰性沒有明顯差異(圖1)?？傮w而言，在25個預測的候選新抗原肽中，有11個具有免疫原性，能特異性刺激CTL分泌IFN-γ，陽性率為44% (11/25)。

2.3 檢測并富集新抗原肽特異性CTL

為確定2輪特異性擴增之后新抗原特異性CTL的比例，選擇C1orf170_S418G413-421、KIAA1683_ M313T311-319、SSX5_E19Q12-20、TMEM185B_A42G42-51和UNC93A_M403T402-410這5個能顯著特異性刺激CTL分泌IFN-γ的候選抗原肽，以及陽性對照抗原肽KRAS_G12V8-16(圖2)，制備pMHC-tetramer-APC。同時用pMHC-tetramer-APC和CD8-PE熒光抗體對特異性刺激的CTL進行染色，發(fā)現(xiàn)抗原肽特異性的CTL的頻率范圍為0.22%~7.08% (圖2A)。根據(jù)誘導T細胞分泌IFN-γ的能力，最終選擇KRAS_G12V8-16和C1orf170_S418G413-421特異的CTL (圖2B)分選后進行單細胞測序，構(gòu)建TCR庫。

2.4 單細胞RNA測序獲得抗原肽特異性TCR庫

為研究識別HLA-A*1101呈遞候選抗原肽C1orf170_S418G413-421的TCR庫，從17,800細胞中分選到9243個陽性T細胞，分別得到14,042個α鏈和9346個β鏈氨基酸序列，其中產(chǎn)生了8826對TCR (α鏈與β鏈配對)，多樣性為298。序列中，基因(55.38%)和基因(37.35%)占主要比例(圖3A)；序列中，基因占99.88% (圖3B)。CDR3α氨基酸長度分布主要在12-mer (55.64%)和15-mer (39.09%) (圖3C)。而序列中，基因占87.47% (圖3D)，序列中，占99.91% (圖3E)。CDR3β氨基酸長度主要分布為15-mer (88.04%) (圖3F)。12-mer和15-mer CDR3α高度保守氨基酸基序分別是CAASGGAQKLVF(圖3G)和CAGLLYNSGNTPLVF (圖3H)，與和相一致，而CDR3β高度保守基序為CASSRDRG-SNQPQHF (圖3I)，與相一致。

最終獲得2個在TCR庫中占主要比例的克隆，53.2% (4694/8826)T細胞(Clonotype1) TCRα為和，TCRβ為；31.6% (2786/8826) T細胞(Clo-notype2)表達的TCRα為，表達的TCRβ為(表2)。

為獲得HLA-A*1101呈遞陽性抗原肽KRAS_ G12V8-16的TCR庫，從21,000個細胞中分選到12,530個陽性T細胞，最終得到11,137個α鏈和13,126個β鏈氨基酸序列，其中產(chǎn)生了10,559對TCR (α鏈與β鏈配對)，多樣性為1610。序列中，基因占81.69% (圖4A)；序列中，基因占99.69% (圖4B)。CDR3α氨基酸長度主要分布在10-mer (81.88%) (圖4C)。而序列中，基因占83.35% (圖4D)，序列中，基因占99.81% (圖4E)。CDR3β氨基酸長度主要分布分別在14-mer (86.4%) (圖4F)。并且10-mer CD3α高度保守氨基酸基序是CASNDYKLSF (圖4G)，與的序列一致；14-mer CDR3β高度保守氨基酸基序是CASSLDGVSYEQYF (圖4H)，與的序列一致。

最終獲得2個在TCR庫中占很大比例的克隆，80.5% (8499/10559) T細胞(Clonotype1) TCRα為，TCRβ為；14.3% (1515/10559)T細胞(Clonotype2) TCRβ為，但是未檢測到表達的TCRα序列(表2)。實驗結(jié)果表明，占主要豐度的TCR基因序列，能夠代表對應TCR庫的基因序列組成。

圖1 T2細胞負載候選多肽刺激CTL分泌IFN-γ

：T2細胞分別負載不同抗原肽，刺激相應新抗原特異性CTL分泌IFN-γ；B：實驗組及對照組產(chǎn)生IFN-γ斑點數(shù)的統(tǒng)計。紅色柱形代表產(chǎn)生的斑點數(shù)比陰性多2倍以上，有顯著性差異；白色柱形代表產(chǎn)生的斑點數(shù)與陰性無顯著性差異。

圖2 流式檢測候選抗原肽特異性CTL的比例

A：擴增2輪后的新抗原特異性CTL陽性率檢測；B：分選新抗原特異性的CTL進行單細胞測序建庫。

2.5 抗原肽特異性的T細胞克隆功能驗證

從TCR庫中選擇比例最高的2個TCR序列(表2)，構(gòu)建TCR-T并驗證功能。流式結(jié)果顯示：C1orf170_S418G413-421特異性TCR-T陽性率為84.1%，KRAS_G12V8-16特異性TCR-T陽性率為68.8% (圖5A)。T2細胞負載抗原肽C1orf170_S418G413-421能特異性激活對應的TCR-T細胞，產(chǎn)生明顯的IFN-γ陽性斑點(圖5B，C1orf170組左上)，而刺激未過表達TCR的CD8+T組僅產(chǎn)生少量背景斑點(圖5B C1orf170組左下)，兩者有顯著性差異，證實此TCR有功能；并且，對比T2細胞負載野生型C1orf170抗原肽(圖5B，C1orf170組中)或無關(guān)多肽(圖5B，C1orf170組右)刺激TCR-T和CD8+T對照組，其斑點數(shù)明顯增多(圖5，B和C)，說明TCR的特異性。T2細胞負載陽性對照抗原肽KRAS_G12V8-16，也能特異性刺激TCR-T細胞產(chǎn)生IFN-γ陽性斑點，與陰性對照組有明顯差異(圖5，B和C)。因此，本研究通過建立的結(jié)直腸癌新抗原特異性T細胞克隆篩選流程，最終獲得2個預測候選抗原肽特異性的TCR克隆，并且具有明顯的細胞免疫功能。相關(guān)數(shù)據(jù)已上傳至CNGB數(shù)據(jù)庫CNSA (https://db.cngb.org/cnsa/)，登錄號為CNP0000518。

圖3 識別HLA-A*1101限制性新抗原C1orf170_S418G413-421的TCR庫特征分析

A：基因序列的組成；B：基因序列的組成；C：TRA CDR3氨基酸長度分布；D：基因序列的組成；E：基因序列的組成；F：TRB CDR3氨基酸長度分布；G：12-mer CDR3α高度保守氨基酸基序；H：15-mer CDR3α高度保守氨基酸基序；I：CDR3β高度保守氨基酸基序。

表2 兩個不同TCR庫中豐度前兩位的TCR α和β鏈配對信息

圖4 識別HLA-A*1101限制性新抗原KRAS_G12V8-16的TCR庫特征分析

A：基因序列的組成；B：基因序列的組成；C：TRA CDR3氨基酸長度分布；D：基因序列的組成；E：基因序列的組成；F：TRB CDR3氨基酸長度分布；G：10-mer CDR3α高度保守氨基酸基序；H：14-mer CDR3β高度保守氨基酸基序。

3 討論

腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中常會獲得大量的體細胞突變，突變基因被翻譯成蛋白質(zhì)后，經(jīng)蛋白酶體水解被MHC分子呈遞在細胞表面，產(chǎn)生新的抗原[10]。腫瘤突變相關(guān)的新抗原在正常組織中并不存在，是腫瘤特有的生物標記物[10]。T細胞識別新抗原并不受胸腺選擇和中樞耐受性的影響，所以人體內(nèi)可能會存在高親和力的新抗原特異性T細胞[7,10]。因此，利用全外顯子、RNA測序并結(jié)合生物信息學流程，可以從單核苷酸分辨率水平揭示腫瘤特異性的改變，并預測用于癌癥免疫治療的新抗原[26]。在確定錯義突變和基因表達水平后，使用各種算法可以評估、預測新抗原多肽與MHC結(jié)合的親和力和呈遞能力[20]。然而研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)預測的新抗原僅有少數(shù)可以引發(fā)T細胞反應[27]。Chizu等[8]通過NetMHC4.0算法預測了26個突變表位與HLA-A*2402具有較強的結(jié)合能力，但利用5種癌癥患者來源的PBMC僅鑒定出1種多肽具有免疫原性。因此，我們認為當前的算法并不理想，可以同時使用多種算法來提高多肽結(jié)合親和力預測的準確性。

本研究使用了多種多肽-MHC結(jié)合親和力預測算法，包括NetMHC-4.0、NetMHCpan-3.0、NetMHCpan-4.0、PSSMHCpan-1.0、PickPocket-1.0和SMM，以及自主開發(fā)的預測表位呈遞的EPIP算法來評估篩選多肽信息，最終獲得25個候選多肽。它們同時滿足了以下條件：SNVs出現(xiàn)頻率為321名患者中超過5人以上(SNVs>5/321)，InDels出現(xiàn)頻率為321個患者中超過2個以上(InDels>2/321)，至少3種軟件預測的IC50值小于50 nmol/L并且EPIP分值≥0.90 (表1)，來評估其呈遞和誘導細胞毒性T細胞的特征。根據(jù)ELISPOT實驗結(jié)果，25個候選多肽中有11個(44%)新抗原可誘導特異性CTL分泌IFN-γ (圖1)。

圖5 所構(gòu)建C1orf170_S418G413-421和KRAS_G12V8-16特異性TCR-T的免疫應答功能驗證

A：流式方法分析實驗組TCR-T與對照組GFP-T的陽性率；B：ELISPOT方法檢測實驗組TCR-T與對照組CD8+TIFN-γ的分泌；C：實驗組TCR-T與對照組CD8+TIFN-γ分泌差異的統(tǒng)計。*：表示有統(tǒng)計學差異；：表示無統(tǒng)計學差異。

預測新抗原的免疫原性通常利用TIL的應答來進行檢測[10,11]。雖然外周血中新抗原反應性T細胞出現(xiàn)的頻率通常低于腫瘤樣品，來源于癌癥患者的循環(huán)CD8+記憶性T細胞或健康志愿者的循環(huán)CD8+初始T細胞的新抗原特異性T細胞，可以通過與負載新抗原的同源DC細胞在體外共培養(yǎng)后富集，利用常規(guī)實驗方法即可檢測它們識別新抗原的應答能力[11,25,28]。因此，本研究采用較易獲得的健康供體的循環(huán)CD8+T細胞與負載新抗原的同源DC共培養(yǎng)兩輪后，來驗證所預測新抗原的免疫原性。除陽性表位KRAS_G12V8-16外，發(fā)現(xiàn)25個預測的抗原中有11個(44%)負載T2細胞后可誘導共培養(yǎng)的CTL分泌IFN-γ (圖1)，并且產(chǎn)生IFN-γ斑點數(shù)超過陰性對照的10倍以上的特異性CTL頻率在0.22%~7.08%之間(圖2A)。其余14個候選新抗原(14/25)并未發(fā)現(xiàn)具有免疫原性，推測是由于一般淋巴結(jié)10E5~10E6個T細胞中才大約只有1個T細胞為新抗原特異性T細胞，而健康供體循環(huán)CD8+記憶T細胞并不會產(chǎn)生新抗原反應性T細胞。因此，在抗原致敏(antigen priming)前富集健康志愿者的循環(huán)CD8+初始T細胞，可以增加特定T細胞遇到呈遞相關(guān)新抗原的DC的可能性[25,29]。此外，由于依賴供體的T細胞群存在個體間差異和人類TCR庫的足夠多樣性，需要篩選多個供體以鑒定候選新抗原的免疫原性[25]。因此，其余免疫原性陰性的新抗原多肽，可能會從其他健康志愿者篩選獲得的陽性的CTL。

在新抗原特異性TCR-T的功能驗證部分，本研究通過對比T2負載新抗原多肽、野生型多肽以及無關(guān)多肽與TCR-T共孵育所產(chǎn)生的ELISPOT斑點，來說明所篩選到的TCR的特異性。實驗發(fā)現(xiàn)C1orf及KRAS兩組T2負載野生型多肽或無關(guān)多肽組也能刺激TCR-T或CD8+T細胞產(chǎn)生少量斑點，可能是由于部分TCR-T或CD8+T細胞為旁觀者激活的T細胞(bystander activated T cells)，處于非特異性的激活狀態(tài)，可分泌IFN-γ細胞因子產(chǎn)生非特異性背景信號[30~32]。此外，通過前期實驗也發(fā)現(xiàn)不同的健康志愿者，甚至同一個健康志愿者不同時間獲取的T細胞，所做ELISPOT背景信號都有差異，分析是由于不同個體或者同一個體不同時間的免疫狀態(tài)的差異，導致背景中旁臨激活的T細胞含量不同產(chǎn)生的。這些信號均為背景信號，并不影響判斷TCR-T有效性的整體趨勢。此外，即使在實驗過程中沒有篩選到突變和野生型抗原組有差別的特異性TCR，從另一角度也證明了此功能性TCR篩選方法的可靠性。

綜上所述，本研究獲得了結(jié)直腸癌中HLA-A* 1101分型C1orf170_S418G413-421的TCR-T，為結(jié)直腸癌過繼TCR-T細胞療法提供了可能，同時證實從體細胞突變數(shù)據(jù)庫中分析獲得高頻且有免疫原性新抗原的方法可行性，可將獲得的新抗原開發(fā)為多肽、DC等疫苗以及TCR-like抗體的結(jié)直腸癌免疫治療通用靶點。同時，此方法也為其他癌種免疫治療靶點的選擇提供了可靠的科研方案，具有重要的臨床意義。

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries., 2018, 68(6): 394–424.

[2] Magee MS, Kraft CL, Abraham TS, Baybutt TR, Marszalowicz GP, Li P, Waldman SA, Snook AE. GUCY2C-directed CAR-T cells oppose colorectal cancer metastases without autoimmunity., 2016, 5(10): e1227897.

[3] Ciardiello D, Vitiello PP, Cardone C, Martini G, Troiani T, Martinelli E, Ciardiello F. Immunotherapy of colorectal cancer: Challenges for therapeutic efficacy., 2019, 76: 22–32.

[4] Parkhurst MR, Yang JC, Langan RC, Dudley ME, Nathan DA, Feldman SA, Davis JL, Morgan RA, Merino MJ, Sherry RM, Hughes MS, Kammula US, Phan GQ, Lim RM, Wank SA, Restifo NP, Robbins PF, Laurencot CM, Rosenberg SA. T cells targeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastatic colorectal cancer but induce severe transient colitis., 2011, 19(3): 620–626.

[5] Zhang CC, Wang Z, Yang Z, Wang ML, Li SQ, Li YY, Zhang R, Xiong ZX, Wei ZH, Shen JJ, Luo YL, Zhang QZ, Liu LM, Qin H, Liu W, Wu F, Chen W, Pan F, Zhang XQ, Bie P, Liang HJ, Pecher G, Qian C. Phase I escalating- dose trial of CAR-T therapy targeting CEA+metastatic colorectal cancers., 2017, 25(5): 1248–1258.

[6] Morgan RA, Yang JC, Kitano M, Dudley ME, Laurencot CM, Rosenberg SA. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2., 2010, 18(4): 843–851.

[7] Zhou Z, Lyu XZ, Wu JC, Yang XY, Wu SS, Zhou J, Gu X, Su ZX, Chen SQ. TSNAD: an integrated software for cancer somatic mutation and tumour-specific neoantigen detection., 2017, 4(4): 170050.

[8] Nonomura C, Otsuka M, Kondou R, Iizuka A, Miyata H, Ashizawa T, Sakura N, Yoshikawa S, Kiyohara Y, Ohshima K, Urakami K, Nagashima T, Ohnami S, Kusuhara M, Mitsuya K, Hayashi N, Nakasu Y, Mochizuki T, Yamaguchi K, Akiyama Y. Identification of a neoantigen epitope in a melanoma patient with good response to anti- PD-1 antibody therapy., 2019, 208: 52–59.

[9] Tran E, Robbins PF, Lu YC, Prickett TD, Gartner JJ, Jia L, Pasetto A, Zheng Z, Ray S, Groh EM, Kriley IR, Rosenberg SA. T-Cell transfer therapy targeting mutant KRAS in cancer., 2016, 375(23): 2255– 2262.

[10] Wirth TC, Kühnel F. Neoantigen targeting-dawn of a new era in cancer immunotherapy?, 2017, 8: 1848.

[11] Cafri G, Yossef R, Pasetto A, Deniger DC, Lu YC, Parkhurst M, Gartner JJ, Jia L, Ray S, Ngo LT, Jafferji M, Sachs A, Prickett T, Robbins PF, Rosenberg SA. Memory T cells targeting oncogenic mutations detected in peripheral blood of epithelial cancer patients., 2019, 10(1): 449.

[12] Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauem?ller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. Reliable predictionof T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations., 2003, 12(5): 1007–1017.

[13] Nielsen M, Andreatta M. NetMHCpan-3.0; improved prediction of binding to MHC class I molecules integrating information from multiple receptor and peptide length datasets., 2016, 8(1): 33.

[14] Jurtz V, Paul S, Andreatta M, Marcatili P, Peters B, Nielsen M. NetMHCpan-4.0: improved Peptide-MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data., 2017, 199(9): 3360–3368.

[15] Liu G, Li DL, Li Z, Qiu S, Li WH, Chao CC, Yang NB, Li HD, Cheng Z, Song X, Cheng L, Zhang XQ, Wang J, Yang HM, Ma K, Hou Y, Li B. PSSMHCpan: a novel PSSM-based software for predicting class I peptide-HLA binding affinity., 2017, 6(5): 1–11.

[16] Zhang H, Lund O, Nielsen M. The PickPocket method for predicting binding specificities for receptors based on receptor pocket similarities: application to MHC-peptide binding., 2009, 25(10): 1293–1299.

[17] Peters B, Sette A. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method., 2005, 6: 132.

[18] Creaney J, Ma S, Sneddon SA, Tourigny MR, Dick IM, Leon JS, Khong A, Fisher SA, Lake RA, Lesterhuis WJ, Nowak AK, Leary S, Watson MW, Robinson BW. Strong spontaneous tumor neoantigen responses induced by a natural human carcinogen., 2015, 4(7): e1011492.

[19] Hu WP, Li YP, Zhang XQ. MHC-I epitope presentation prediction based on transfer learning.41(11): 1041–1049.胡偉澎, 李佑平, 張秀清. 基于遷移學習的MHC-I型抗原表位呈遞預測.遺傳, 41(11): 1041–1049.

[20] Hu WP, Qiu S, Li YP, Lin XX, Zhang L, Xiang HT, Han X, Chen L, Li S, Li WH, Ren Z, Hou GX, Lin ZL, Lu JL, Liu G, Li B, Lee LJ. EPIP: MHC-I epitope prediction integrating mass spectrometry derived motifs and tissue- specific expression profile., 2019, 567081.

[21] Tanyi JL, Bobisse S, Ophir E, Tuyaerts S, Roberti A, Genolet R, Baumgartner P, Stevenson BJ, Iseli C, Dangaj D, Czerniecki B, Semilietof A, Racle J, Michel A, Xenarios I, Chiang C, Monos DS, Torigian DA, Nisenbaum HL, Michielin O, June CH, Levine BL, Powell DJ Jr, Gfeller D, Mick R, Dafni U, Zoete V, Harari A, Coukos G, Kandalaft LE. Personalized cancer vaccine effectively mobilizes antitumor T cell immunity in ovarian cancer., 2018, 10(436): eaao5931.

[22] Yamamiya D, Mizukoshi E, Kaji K, Terashima T, Kitahara M, Yamashita T, Arai K, Fushimi K, Honda M, Kaneko S. Immune responses of human T lymphocytes to novel hepatitis B virus-derived peptides., 2018, 13(6): e0198264.

[23] Rodenko B, Toebes M, Hadrup SR, van Esch WJ, Molenaar AM, Schumacher TN, Ovaa H. Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange., 2006, 1(3): 1120–1132.

[24] Kim MS, Ma JS, Yun HY, Cao Y, Kim JY, Chi V, Wang D, Woods A, Sherwood L, Caballero D, Gonzalez J, Schultz PG, Young TS, Kim CH. Redirection of genetically engineered CAR-T cells using bifunctional small molecules., 2015, 137(8): 2832–2835.

[25] Ali M, Foldvari Z, Giannakopoulou E, B?schen ML, Str?nen E, Yang W, Toebes M, Schubert B, Kohlbacher O, Schumacher TN, Olweus J. Induction of neoantigen- reactive T cells from healthy donors., 2019, 14(6): 1926–1943.

[26] Lancaster EM, Jablons D, Kratz JR. Applications of next-generation sequencing in eoantigen prediction and cancer vaccine development., 2019, 24(2): 59–66.

[27] The problem with neoantigen prediction., 2017, 35(2): 97.

[28] Cohen CJ, Gartner JJ, Horovitz-Fried M, Shamalov K, Trebska-McGowan K, Bliskovsky VV, Parkhurst MR, Ankri C, Prickett TD, Crystal JS, Li YF, El-Gamil M, Rosenberg SA, Robbins PF. Isolation of neoantigen- specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes., 2015, 125(10): 3981–3991.

[29] Lin QY, Liu Z, Luo MJ, Zheng H, Qiao S, Han CL, Deng DQ, Fan Z, Lu YF, Zhang ZH, Luo QM. Visualizing DC morphology and T cell motility to characterize DC-T cell encounters in mouse lymph nodes under mTOR inhibition., 2019, 62(9): 1168–1177.

[30] Simoni Y, Becht E, Fehlings M, Loh CY, Koo SL, Teng KWW, Yeong JPS, Nahar R, Zhang T, Kared H, Duan K, Ang N, Poidinger M, Lee YY, Larbi A, Khng AJ, Tan E, Fu C, Mathew R, Teo M, Lim WT, Toh CK, Ong BH, Koh T, Hillmer AM, Takano A, Lim TKH, Tan EH, Zhai W, Tan DSW, Tan IB, Newell EW. Bystander CD8+T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates., 2018, 557(7706): 575–579.

[31] Whiteside SK, Snook JP, Williams MA, Weis JJ. Bystander T Cells: a balancing act of friends and foes., 2018, 39(12): 1021–1035.

[32] Kim TS, Shin EC. The activation of bystander CD8+T cells and their roles in viral infection., 2019, 51(12): 1–9.

A method of screening highly common neoantigens with immunogenicity in colorectal cancer based on public somatic mutation library

Lili Qin1,2, Yijian Li1, Zhaoduan Liang1, Lei Chen1, Wenhui Li1, Chao Chen1,3,4, Yaling Huang1, Le Zhang1,3,4, Songming Liu1,3,4, Si Qiu1,4, Yuping Ge1, Wenting Peng1,3, Xinxin Lin1,4, Xiuqing Zhang1,4, Xuan Dong1, Bo Li1,4

Colorectal cancer (CRC) is a malignant cancer with high incidence and mortality in the world. Immunotherapy targeting neoantigens can induce durable tumor regression in cancer patients, but is almost limited to personalized precision therapy, due to the individual differences of unique neoantigens. With the discovery of many common oncogenic mutations, and such mutation-associated neoantigens could cover more patients, and hence are valuable in clinical field. However, whether the common neoantigens can be identified in CRC is unknown. Combining the somatic mutations data from 321 CRC patients with a filter standard and 7 predicted algorithms, we screened and obtained 25 HLA-A*1101-restricted common neoantigens with a high binding affinity (IC50<50 nmol/L) and presentation score (>0.90). Besides the positive epitope KRAS_G12V8-16, 11 out of 25 common neoantigens specifically inducedpre- stimulated cytotoxic lymphocyte (CTL) to secrete interferon gamma (IFN-γ). Moreover, combining cell-sorting technology and single-cell RNA sequencing, the immune repertoire profiles of C1orf170_S418G413-421and KRAS_G12V8-16-specific CTL were analyzed and validated. Their related T-cell receptor engineered T cell (TCR-T) cells could also recognize the neoantigens and secrete IFN-γ. Hence, we have established a method to screen for common neoantigens with immunogenicity in CRC based on the public somatic mutation library. It can provide essential peptide and TCR information for immunotherapies, such as peptides, dendritic cells (DC) vaccines, TCR-like antibodies, TCR-T, etc., for the CRC and other cancers, which has practical application value in the clinics.

colorectal cancer; common; neoantigen; presentation

2020-04-10;

2020-05-15

國家自然科學基金項目(編號：81702826)和深圳市科技創(chuàng)新委員會項目(編號：JCYJ20170303151334808, JCYJ20170817150015170)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81702826), and Science, Technology and Innovation Commission of Shenzhen Municipality (Nos. JCYJ20170303151334808, JCYJ20170817150015170)]

秦麗麗, 在讀碩士研究生，專業(yè)方向：病理學和病理生理學。E-mail: veritasdoct168@163.com李毅堅，碩士，助理研究員，研究方向：腫瘤免疫治療。E-mail: liyijian@genomics.cn秦麗麗和李毅堅為并列第一作者。

董旋，博士，副研究員，研究方向：腫瘤免疫治療。E-mail: dongxuan@genomics.cn李波，碩士，研究員，研究方向：基因組學及免疫治療。E-mail: libo@genomics.cn

10.16288/j.yczz.20-032

2020/5/20 16:44:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200520.0831.001.html

(責任編委: 周鋼橋)