CRISPR/Cas核糖核蛋白介導(dǎo)的植物基因組編輯

李霞，施皖，耿立召，許建平

綜 述

CRISPR/Cas核糖核蛋白介導(dǎo)的植物基因組編輯

李霞，施皖，耿立召，許建平

先正達(dá)北京創(chuàng)新中心，北京 102206

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系統(tǒng)作為一種重要的基因編輯工具，自誕生以來被廣泛應(yīng)用于作物的性狀改良。與CRISPR/Cas DNA載體介導(dǎo)的植物基因組編輯相比，CRISPR/Cas核糖核蛋白(CRISPR/Cas ribonucleoprotein, CRISPR/Cas RNP)介導(dǎo)的植物基因組編輯具有作用迅速、脫靶率低和無外源DNA插入(DNA-free)等優(yōu)點(diǎn)，因而無需清除CRISPR編輯工具而更容易獲得純合的編輯體。但是，由于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和細(xì)胞再生技術(shù)的限制，不借助篩選標(biāo)記的輔助將CRISPR/Cas RNP直接導(dǎo)入植物細(xì)胞并獲得高效基因編輯仍比較困難，直接限制了CRISPR/Cas RNP在植物基因組編輯中的廣泛應(yīng)用。本文系統(tǒng)介紹了CRISPR/Cas RNP 基因組編輯技術(shù)的分子作用機(jī)理及其優(yōu)勢，并總結(jié)了CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法，最后對CRISPR/Cas RNP在植物基因組編輯中的新應(yīng)用和新思路進(jìn)行了展望，以期為進(jìn)一步改進(jìn)CRISPR/Cas RNP基因組編輯技術(shù)和擴(kuò)大其在作物改良中的應(yīng)用提供參考。

CRISPR/Cas；基因編輯；核糖核蛋白；無外源DNA插入；植物轉(zhuǎn)化

實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、高效的基因組修飾是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的研究目標(biāo)之一。近年來，基因組編輯技術(shù)，尤其是成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)成為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的最重要工具[1]。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有靈活、高效、操作簡單等特點(diǎn)，因此在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)造新的植物突變?nèi)后w[2]。但是，利用傳統(tǒng)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌或基因槍介導(dǎo)的CRISPR/Cas DNA的轉(zhuǎn)化，在目標(biāo)基因被編輯的編輯體基因組中通常留有隨機(jī)插入編碼CRISPR/Cas的外源DNA片段，對基因編輯產(chǎn)品的安全和政府監(jiān)管提出了較大的挑戰(zhàn)[3]。因此，無外源DNA(DNA-free)的基因組編輯技術(shù)在簡化政府監(jiān)管以及提高大眾對基因編輯產(chǎn)品的接受度等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中具有極高應(yīng)用價(jià)值[4,5]。

CRISPR/Cas核糖核蛋白(CRISPR/Cas ribonu-cleoprotein, CRISPR/Cas RNP)復(fù)合體介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前最重要的無外源DNA整合在植物基因組上的編輯技術(shù)之一。該技術(shù)摒棄了編碼Cas蛋白和向?qū)NA的DNA載體，在試管中將純化的Cas蛋白和向?qū)NA預(yù)先組裝成具備完整活性的CRISPR/Cas RNP復(fù)合體，再將CRISPR/Cas RNP通過物理或者化學(xué)的方法直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，從源頭上避免了在植物基因組中插入外源DNA[6]。同時(shí)，因?yàn)閷?dǎo)入的是具有完整活性的CRISPR/Cas RNP復(fù)合體，CRISPR/Cas RNP進(jìn)入細(xì)胞后可以立即發(fā)揮功能，迅速切割靶位點(diǎn)的基因組DNA；又由于Cas蛋白和向?qū)NA的半衰期均較短，細(xì)胞中又沒有新的Cas蛋白和向?qū)NA持續(xù)合成，所以CRISPR/Cas RNP對基因組DNA的切割被限定在一個(gè)短暫的時(shí)間內(nèi)，得到的編輯產(chǎn)物在嵌合率和脫靶率方面均優(yōu)于使用編碼Cas蛋白和向?qū)NA的DNA載體得到的編輯產(chǎn)物[6,7]。但是，由于目前植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和細(xì)胞再生技術(shù)的限制，在沒有篩選標(biāo)記的情況下，將CRISPR/Cas RNP直接導(dǎo)入植物細(xì)胞并高效獲得基因編輯體仍比較困難，成本較高，限制了CRISPR/ Cas RNP在植物基因組編輯中的廣泛應(yīng)用[5,8]。本文主要總結(jié)了CRISPR/Cas RNP基因組編輯技術(shù)的分子機(jī)制及優(yōu)勢、CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法，并對CRISPR/Cas RNP的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 CRISPR/Cas RNP基因組編輯技術(shù)分子機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于原核生物基因組中，是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒攻擊而演化形成的獲得性免疫防御機(jī)制[9,10]。CRISPR序列中存儲(chǔ)著若干一定長度的、病毒來源的DNA片段，可經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體CRISPR RNA (pre-crRNA)。Pre-crRNA進(jìn)一步被加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟CRISPR RNA (crRNA)，能通過堿基配對識(shí)別入侵的病毒DNA。Cas是CRISPR相關(guān)蛋白，一些特定的Cas蛋白是受RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，即能在crRNA的引導(dǎo)下識(shí)別并切割病毒基因組中的特定核酸片段，被切割的病毒基因組受到宿主細(xì)胞內(nèi)核酸酶的影響而被降解或失去功能，使自身免于遭受病毒侵染[1,9,11]。由于CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠根據(jù)需求而設(shè)計(jì)識(shí)別和切割特定的目標(biāo)DNA序列，近年來成為高效的真核生物基因組編輯工具[12]。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)中，CRISPR/Cas9[13]和CRISPR/Cas12a (舊稱Cpf1[14,15])是在基因組編輯領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的兩套系統(tǒng)。

1.1 CRISPR/Cas9 RNP系統(tǒng)分子機(jī)制

CRISPR/Cas9屬于II-A型CRISPR系統(tǒng)[16]，具有雙分子的向?qū)NA[17,18]。crRNA通過堿基配對與反式激活CRISPR RNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)結(jié)合形成雜合雙鏈RNA，可引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別并切斷靶標(biāo)雙鏈DNA。在實(shí)際應(yīng)用中，可將tracrRNA和crRNA人工融合成一條嵌合的單分子向?qū)NA (single guide RNA, sgRNA)[19]，sgRNA能代替天然的雙分子向?qū)NA起到相同的引導(dǎo)作用[18]，并大幅提高了切割效率。Cas:sgRNA二元復(fù)合體首先掃描目標(biāo)DNA分子，尋找特定的前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)。該二元復(fù)合體定位并結(jié)合到PAM上游后，會(huì)打開DNA雙鏈形成R環(huán)(R-loop)，由crRNA的間隔序列(spacer)與目標(biāo)DNA的前間隔序列(protospacer)配對進(jìn)行互補(bǔ)性檢測。當(dāng)間隔序列和前間隔序列形成足夠穩(wěn)定的互補(bǔ)配對，Cas9的構(gòu)象將發(fā)生改變，激活兩個(gè)切割DNA單鏈的催化域——HNH催化域切割DNA與crRNA互補(bǔ)的鏈(又稱靶向鏈)，同時(shí)類RuvC催化域切割非互補(bǔ)鏈(又稱非靶向鏈)，結(jié)果造成PAM上游第3和第4個(gè)堿基對間引入平末端的DNA雙鏈斷裂[18,20]。CRISPR/Cas9 RNP系統(tǒng)即是Cas9:sgRNA二元復(fù)合體，CRISPR/Cas9 RNP的構(gòu)成及其識(shí)別和切割雙鏈DNA的機(jī)理如圖1A所示。在真核細(xì)胞中，基因組DNA的雙鏈斷裂會(huì)被非同源末端連接(non- homologous end-joining, NHEJ)或同源重組介導(dǎo)的修復(fù)(homology-directed repair, HDR)途徑修復(fù)[13]。通過CRISPR/Cas9的定向切割產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂和生物體本身的修復(fù)途徑，可以方便快捷地實(shí)現(xiàn)基因敲除、敲入、定點(diǎn)突變等基因組編輯[4,13]。

1.2 CRISPR/Cas12a RNP系統(tǒng)分子機(jī)制

CRISPR/Cas12a屬于V-A型CRISPR系統(tǒng)[16]，與CRISPR/Cas9相似，可以定點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂，因而也被改造成基因組編輯工具[17]。與CRISPR/ Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)主要有以下特點(diǎn)：(1) Cas12a天然使用單分子導(dǎo)向RNA，不需要tracrRNA，只需要一個(gè)crRNA分子(42個(gè)核苷酸)，比Cas9的sgRNA (100個(gè)核苷酸左右)短很多，因此Cas12a的crRNA更容易通過化學(xué)合成獲得[14]； (2) Cas12a的基因較小，DNA載體更容易操作； (3) Cas12a切割雙鏈DNA后產(chǎn)生4~5 bp的5′突出末端(staggered overhang)，有研究表明這種粘性末端的修復(fù)更有利于HDR途徑，利于實(shí)現(xiàn)HDR介導(dǎo)的精準(zhǔn)基因編輯[21]；(4)與Cas9識(shí)別高GC含量的PAM(NGG)互為補(bǔ)充，Cas12a識(shí)別高AT含量的PAM (TTTV或TTV)，大大擴(kuò)展了基因組編輯靶點(diǎn)的范圍[22,23]；(5) Cas12a同時(shí)具有核糖核酸酶(RNase)活性，能對自身的pre-crRNA進(jìn)行識(shí)別并加工獲得成熟crRNA，使得在對多個(gè)基因組位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)編輯時(shí)，向?qū)NA陣列的設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)更簡便[24]。與CRISPR/Cas9 RNP相似，CRISPR/Cas12a RNP系統(tǒng)是Cas12a蛋白與crRNA的復(fù)合體，CRISPR/Cas12a RNP構(gòu)成及其識(shí)別和切割雙鏈DNA的機(jī)理如圖1B所示。

2 CRISPR/Cas RNP技術(shù)應(yīng)用于植物基因組編輯的優(yōu)勢

目前CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于作物的性狀改良，最常用的技術(shù)路線是首先采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊的方法將編碼CRISPR/ Cas系統(tǒng)的DNA載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，由DNA載體在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯組裝出CRISPR/Cas復(fù)合體進(jìn)行基因編輯，再通過篩選、再生、鑒定得到編輯體植株[4]。在這些轉(zhuǎn)化過程中，CRISPR/Cas系統(tǒng)的編碼序列一般會(huì)整合到植物基因組中，加之Cas基因多由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，這樣會(huì)導(dǎo)致編輯系統(tǒng)在各個(gè)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，從而增加非靶標(biāo)位點(diǎn)被突變的風(fēng)險(xiǎn)，即增加了脫靶突變的幾率；同時(shí)也會(huì)增加不同細(xì)胞中發(fā)生不同類型突變，即增加嵌合突變體的幾率[6,25]。CRISPR/Cas RNP則以具有活性的完整復(fù)合體直接導(dǎo)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞核后即可迅速發(fā)揮功能；另一方面由于沒有持續(xù)的基因表達(dá)，導(dǎo)入細(xì)胞的CRISPR/Cas RNP會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)降解，不會(huì)隨細(xì)胞分裂而增殖，并且CRISPR/Cas RNP切割染色體靶位點(diǎn)作用迅速而短暫，能使脫靶率和嵌合率都顯著降低[6,7,26,27]。

圖1 CRISPR/Cas RNP系統(tǒng)構(gòu)成和作用機(jī)理

A：CRISPR/Cas9 RNP系統(tǒng)構(gòu)成和作用機(jī)理；B：CRISPR/Cas12a RNP系統(tǒng)構(gòu)成和作用機(jī)理。

此外，DNA載體的片段還可能隨機(jī)插入到植物基因組各處，產(chǎn)生非預(yù)期的基因序列改變[28~30]，造成潛在的非預(yù)期的產(chǎn)品安全問題。多數(shù)作物必須額外花費(fèi)一代或多代的時(shí)間，通過自交或回交將這些非預(yù)期的外源序列分離出去。而葡萄(L.)、馬鈴薯(L.)和香蕉(Colla)等無性繁殖的作物，則無法通過自交或雜交分離外源DNA[6]。由于CRISPR/Cas RNP不含任何外源DNA的組分，從源頭上避免了外源DNA插入基因組的可能，大大節(jié)省了獲得無外源DNA插入的基因組編輯植株所需的時(shí)間，也使無性繁殖作物中得到無外源DNA插入的基因組編輯植株成為可能[6,30]。

在基因組編輯試劑的前期準(zhǔn)備方面，CRISPR/ Cas RNP也比傳統(tǒng)的DNA載體更為簡便。Cas蛋白可以在大腸桿菌中大量表達(dá)和純化，向?qū)NA可以通過化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄迅速制備，甚至可以直接訂購商業(yè)化的成品蛋白和向?qū)NA，省去了構(gòu)建和驗(yàn)證載體的大量繁瑣工作[31,32]。這一優(yōu)勢在對多靶點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行編輯時(shí)尤為突出，可直接將Cas蛋白和多條向?qū)NA按一定比例在室溫下混勻孵育后即可進(jìn)入轉(zhuǎn)化流程，具有極強(qiáng)的靈活性[33,34]。

3 CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法

蛋白質(zhì)由于分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且必須維持正確的三維結(jié)構(gòu)才能保證活性，因此將活性蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的難度較大。CRISPR/Cas RNP是蛋白質(zhì)與核酸的功能復(fù)合體，空間結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，因而導(dǎo)入植物細(xì)胞更有挑戰(zhàn)性[35]。電穿孔和顯微注射技術(shù)可以把CRISPR/Cas RNP直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞[33,36,37]。最近研究表明，用于核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽離子脂質(zhì)體也可協(xié)助將CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞[35]：向?qū)NA所帶的強(qiáng)負(fù)電荷使CRISPR/Cas RNP整體帶負(fù)電，與陽離子脂質(zhì)體通過靜電作用結(jié)合，形成被脂質(zhì)體包裹的顆粒，通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[35,38]。該方法的優(yōu)勢在于對細(xì)胞傷害小，且脂質(zhì)體包裹保護(hù)了CRISPR/Cas RNP的完整性和活性[35]。

植物細(xì)胞比動(dòng)物細(xì)胞多出一道物理屏障——細(xì)胞壁，這就決定了將生物大分子導(dǎo)入植物細(xì)胞必須采用與導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞截然不同的策略[26]?；仡櫮壳耙寻l(fā)表的將CRISPR/Cas RNP用于植物基因組編輯的研究，大多數(shù)先通過酶解消化細(xì)胞壁得到原生質(zhì)體，然后通過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入。該方法已經(jīng)在多種植物細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas RNP介導(dǎo)的基因組編輯[6,39~43](表1)。但由于技術(shù)的限制，僅生菜(L.)[6]、馬鈴薯[43]等少數(shù)植物種類的原生質(zhì)體可以再生，大多數(shù)植物的原生質(zhì)體還無法再生成為完整植株[44,45]，也就無法通過原生質(zhì)體得到能夠穩(wěn)定遺傳的基因組編輯完整植物株系。但也有研究另辟蹊徑，將體外分離的水稻(L. cv. Nipponbare)精細(xì)胞和卵細(xì)胞電擊融合產(chǎn)生無細(xì)胞壁的合子，再以PEG介導(dǎo)將CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入進(jìn)行基因組編輯，被編輯的合子可繼續(xù)發(fā)育成可穩(wěn)定遺傳的完整植株[46]。

除了以PEG介導(dǎo)的RNP復(fù)合物導(dǎo)入原生質(zhì)體的方法外，基因槍也是常用的將CRISPR/Cas RNP復(fù)合物導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法之一。將生物大分子如CRISPR/Cas RNP復(fù)合物通過特定的方法包裹在微米甚至納米級(jí)的金粉微粒上，通過基因槍將金粉轟擊到玉米(L.)[26]、小麥(L.)[30]等單子葉作物幼胚或預(yù)誘導(dǎo)的愈傷組織中，能夠在7~9周內(nèi)獲得再生的由RNP基因編輯的完整植株[47]。陽離子脂質(zhì)體被認(rèn)為可以幫助CRISPR/Cas RNP形成更大的復(fù)合體，有助于RNP復(fù)合體與金粉顆粒的結(jié)合，從而提高導(dǎo)入效率[26]。但也有研究表明CRISPR/Cas RNP不需要額外的介質(zhì)(如陽離子脂質(zhì)體)協(xié)助也能有效結(jié)合到金粉微粒上，可以進(jìn)一步簡化實(shí)驗(yàn)操作及降低成本[30]。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)的不斷發(fā)展，植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的新方法層出不窮，這意味著會(huì)有更多、更有效的CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入細(xì)胞的方法。最近新發(fā)現(xiàn)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)可能是CRISPR/ Cas RNP導(dǎo)入植物細(xì)胞更有效的新方法[49,50]。CPP是一系列長度一般不超過30個(gè)氨基酸的短肽，通常凈帶正電，同時(shí)兼有親水和疏水兩性基團(tuán)。CPP介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制目前尚不明確，有時(shí)會(huì)部分通過胞吞途徑，但似乎不依賴于受體和能量。CPP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)優(yōu)勢在于低毒性和無細(xì)胞類型的限制，協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)的大小范圍可以從小分子化合物到蛋白甚至是超大分子粒子[51]。目前已有研究利用CPP將β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)蛋白成功導(dǎo)入到黑小麥(×Witt.)的小孢子中[52]，但還未見利用CPP將CRISPR/Cas RNP導(dǎo)入植物細(xì)胞的報(bào)道。

表1 利用CRISPR/Cas RNP介導(dǎo)的植物基因組編輯研究

續(xù)表

PEG：聚乙二醇。

納米材料也日益成為遞送生物分子的常用手段[53]。目前已有研究將納米材料表面鋪敷精氨酸，使納米材料帶上正電，并將谷氨酸肽(E-tag)融合到Cas9蛋白的N端，使Cas9帶上負(fù)電。帶電荷的納米材料和Cas9-E-tag融合蛋白通過正負(fù)電荷作用結(jié)合，可攜帶融合蛋白在一系列不同的細(xì)胞類型中獲得至高可達(dá)90%的導(dǎo)入效率，基因編輯效率最高可達(dá)30%[38]。碳納米管是另一種新興的納米材料，能夠以無機(jī)械輔助的方式高效地將DNA遞送到多種植物細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)無轉(zhuǎn)基因整合的DNA遞送和瞬時(shí)基因表達(dá)[54]，結(jié)合CRISPR/Cas系統(tǒng)能達(dá)到導(dǎo)入CRISPR/Cas RNP同樣的效果，也可能成為未來植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因組編輯的方向之一。

CRISPR/Cas RNP的應(yīng)用范圍也將不斷拓寬，不再局限于定點(diǎn)進(jìn)入DNA雙鏈斷裂、后經(jīng)NHEJ途徑修復(fù)得到定點(diǎn)突變或經(jīng)HDR途徑修復(fù)得到精準(zhǔn)編輯。所有CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)的功能，都可以通過向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入CRISPR/Cas RNP實(shí)現(xiàn)，如基于CRISPR/Cas的單堿基編輯器、基因表達(dá)調(diào)控器等[12,34,55]。目前已有研究將高保真的CRISPR/Cas單堿基編輯器以RNP形式導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，建立DNA-free的單堿基編輯系統(tǒng)，比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有更高的特異性，脫靶率也更低[55,56]。

任何技術(shù)都不可避免存在缺陷，CRISPR/Cas RNP介導(dǎo)的植物基因組編輯技術(shù)首先亟待解決的問題是實(shí)現(xiàn)可穩(wěn)定遺傳的編輯效率仍然較低，這一不足有望通過進(jìn)一步改造Cas蛋白和向?qū)NA來提高CRISPR/Cas RNP的穩(wěn)定性和生物活性[57]，以及進(jìn)一步提高CRISPR/Cas導(dǎo)入細(xì)胞特別是細(xì)胞核的效率來改進(jìn)。多項(xiàng)在動(dòng)物細(xì)胞中的研究提示增加融合在Cas蛋白上的核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS)的數(shù)量和優(yōu)化NLS的位置編排可以有效改善CRISPR/Cas RNP的編輯效率[58,59]。另外，CRISPR/Cas RNP的DNA-free特性使得轉(zhuǎn)化過程缺乏有效的篩選標(biāo)記，后期需再生大量植株，導(dǎo)致組織培養(yǎng)和分子檢測的工作量較大[8,26,30]。近期一項(xiàng)在硅藻(Bohlin.)中的研究巧妙利用CRISPR/Cas RNP多位點(diǎn)同時(shí)編輯的靈活性，在編輯目的性狀基因的同時(shí)編輯內(nèi)源基因作為篩選標(biāo)記，為解決DNA-free的篩選問題提示了新方向[60]。隨著CRISPR/Cas RNP研究的不斷深入和技術(shù)的不斷改進(jìn)，其應(yīng)用會(huì)越來越廣，必將會(huì)給植物基因組編輯技術(shù)帶來革命性的進(jìn)步。

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Genome editing in plants directed by CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes

Xia Li, Wan Shi, Lizhao Geng, Jianping Xu

The CRISPR/Cas system is the most popular genome editing technology in recent years and has been widely used in crop improvement. Compared with introducing the CRISPR/Cas system into plant cells with DNA constructs, introducing CRISPR/Cas ribonucleoprotein (RNP) to perform genome editing excels in rapid action, low off-target rates and is free of DNA insertions in editing plants. However, efficient delivery of CRISPR/Cas RNP into plant cells and achieving high editing frequency are still very challenging, which limits the extensive implementation of CRISPR/Cas RNP-mediated genome editing in plants. In this review, we summarize the progress of protein and RNP delivery methods in plant cells, and provide new perspectives of further development and future applications of the CRISPR/Cas RNP technology in plant genome editing.

CRISPR/Cas; genome editing;ribonucleoprotein (RNP); DNA-free; plant transformation

2020-01-13;

2020-04-27

李霞，博士，研究方向：植物遺傳轉(zhuǎn)化和植物基因組編輯。E-mail: 46831067@qq.com

許建平，博士，資深首席科學(xué)家，先正達(dá)全球基因編輯技術(shù)科學(xué)主管，研究方向：植物生物技術(shù)和植物基因組編輯。E-mail: jianping.xu@syngenta.com

10.16288/j.yczz.20-017

2020/5/22 15:02:51

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200522.1220.003.html

(責(zé)任編委: 高彩霞)