利用Trim-Away技術(shù)降低人胰島淀粉樣多肽在大鼠胰島素瘤細(xì)胞中的毒性

龔葭薇，孔德麟，楊琳，聶玉哲，梁洋，滕春波

研究報(bào)告

利用Trim-Away技術(shù)降低人胰島淀粉樣多肽在大鼠胰島素瘤細(xì)胞中的毒性

龔葭薇，孔德麟，楊琳，聶玉哲，梁洋，滕春波

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040

人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide, hIAPP)又稱胰淀素(Amylin)，是胰島β細(xì)胞中胰島素的共分泌蛋白，與胰島素共同包裹在囊泡中被分泌出細(xì)胞。正常生理?xiàng)l件下，hIAPP有助于胰島素分泌并調(diào)節(jié)機(jī)體血糖平衡；但其蛋白錯(cuò)誤折疊或過(guò)量積累則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性，進(jìn)而影響β細(xì)胞功能，導(dǎo)致機(jī)體罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。為了清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累的hIAPP，且不影響其正常的合成功能，本研究選用一種新的蛋白質(zhì)降解技術(shù)——Trim-Away，該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)降解目標(biāo)蛋白質(zhì)，且不會(huì)對(duì)靶蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯等功能產(chǎn)生影響。首先在大鼠()胰島素瘤細(xì)胞(insulinoma cells, INS1)中過(guò)表達(dá)模擬其過(guò)度累積的情況，并通過(guò)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的釋放、CCK8 (cell counting kit-8)的活性以及PI-Annexin V流式檢測(cè)的陽(yáng)性比例變化，證明hIAPP的過(guò)度積累造成β細(xì)胞的凋亡；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胰島素的合成和分泌都受到了阻礙；最后利用Trim-Away技術(shù)在過(guò)表達(dá)的INS1細(xì)胞中特異性清除了過(guò)度積累的hIAPP蛋白。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)清除hIAPP蛋白可以減少細(xì)胞的死亡，ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)INS1細(xì)胞恢復(fù)了胰島素的分泌能力。本研究驗(yàn)證了hIAPP過(guò)度積累對(duì)INS1細(xì)胞的毒性作用，并且證明Trim-Away技術(shù)在清除胰腺β細(xì)胞中hIAPP毒性具有效果，為利用Trim-Away治療糖尿病提供了新的策略。

Trim-Away；人胰島淀粉樣多肽；β細(xì)胞；胰島素分泌

人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid poly-peptide, hIAPP)是一種由37 aa構(gòu)成的神經(jīng)內(nèi)分泌多肽激素[1]，也被稱為胰淀素(amylin)[2]。由89 aa構(gòu)成的前激素原preproIAPP經(jīng)歷蛋白水解及翻譯后修飾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上被加工成熟[1]，隨后處于分泌泡外圍，與核心的胰島素、鋅離子共分泌[3]。正常生理?xiàng)l件下，hIAPP協(xié)助胰島素調(diào)節(jié)胃排空和飽腹感來(lái)維持血糖平衡[4]。hIAPP的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致其極易產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊，不斷累積的錯(cuò)誤折疊的hIAPP在機(jī)體胰島素抵抗情況下抑制胰島素分泌[5]，并且hIAPP本身分泌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胰島素，在細(xì)胞內(nèi)外累積形成淀粉樣多肽沉積[6]。1901年，Opie等[7]首次觀察到hIAPP累積現(xiàn)象，這種現(xiàn)象被描述為“胰島透明樣化”。最初并非所有糖尿病患者體內(nèi)都能觀察到hIAPP累積，目前超過(guò)90%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者體內(nèi)存在該現(xiàn)象[8]。對(duì)動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，hIAPP的累積先于β細(xì)胞功能紊亂和其他T2DM臨床癥狀的發(fā)生[9]。研究表明，hIAPP累積會(huì)在脂質(zhì)雙分子層上形成非選擇性離子通道，破壞脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，產(chǎn)生β細(xì)胞毒性[10]。在hIAPP聚集過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基，引起DNA損傷[11]；hIAPP的寡聚體會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、對(duì)線粒體造成損傷[12]，使細(xì)胞功能受損、數(shù)量減少，從而誘導(dǎo)人體罹患T2DM。在T1DM胰腺移植失敗患者體內(nèi)的大多數(shù)胰島中也檢測(cè)到hIAPP的累積，表明hIAPP累積是導(dǎo)致移植失敗的因素之一[13]。

目前在細(xì)胞水平上降低目的蛋白表達(dá)主要有兩種方式：一種是利用CRISPR對(duì)基因組DNA進(jìn)行敲除；另一種是利用shRNA、siRNA等對(duì)mRNA進(jìn)行敲低。而Trim-Away技術(shù)則是在蛋白水平上直接降解目標(biāo)蛋白質(zhì)，該技術(shù)既不需要對(duì)內(nèi)源蛋白質(zhì)做任何修飾，還可以在短時(shí)間內(nèi)完成目的蛋白降解[14~16]。Trim21是TRIM家族成員之一，它具有E3泛素連接酶活性，是細(xì)胞內(nèi)抗體的特異性受體。在細(xì)胞里表達(dá)并轉(zhuǎn)入目的蛋白的抗體后，抗體會(huì)與目的蛋白結(jié)合，Trim21去識(shí)別抗體的Fc端，并能通過(guò)自身的RING結(jié)構(gòu)域連接泛素蛋白酶體，形成蛋白酶體復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解[17~19]。

為了保護(hù)胰腺β細(xì)胞免受hIAPP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，本研究在大鼠()胰島素瘤細(xì)胞(insulinoma cells, INS1)中過(guò)表達(dá)建立β細(xì)胞功能障礙模型，利用Trim-Away技術(shù)清除細(xì)胞內(nèi)外累積的hIAPP。通過(guò)碘化丙啶(propidium iodide, PI)、CCK8 (cell counting kit-8)以及胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)等，發(fā)現(xiàn)清除累積的hIAPP可以抑制細(xì)胞死亡，恢復(fù)細(xì)胞增殖能力、胰島素合成和分泌能力。由此證明利用Trim-Away技術(shù)可以清除細(xì)胞內(nèi)外累積的hIAPP，并且該技術(shù)不影響新生的hIAPP和胰島素，這對(duì)于調(diào)節(jié)由hIAPP累積引發(fā)的T2DM的血糖水平具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 hIAPP和Trim21過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

提取人胰腺組織(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)) RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增獲得片段；選用I或R I酶切位點(diǎn)，通過(guò)同源重組連接的方法，將片段連接到lv3-copGFP或pcDNA3.1載體(蘇州吉瑪基因公司)上，lv3- hIAPP-copGFP中與融合表達(dá)。

分別以人肝癌細(xì)胞HepG2和大鼠INS1細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段與，選用R I酶切位點(diǎn)，通過(guò)同源重組連接的方法，將與分別連接到pcDNA3.1載體上。

序列合成及載體測(cè)序由吉林庫(kù)美生物公司完成，PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 本研究使用的引物序列

PCR擴(kuò)增引物序列中，大寫字母表示目的基因的cDNA序列，小寫字母表示基礎(chǔ)載體的同源臂序列，下劃線表示酶切位點(diǎn)識(shí)別序列。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及載體轉(zhuǎn)染

大鼠INS1細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司) 中，添加10%胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES(美國(guó)Gibco公司)、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素(美國(guó)HyClone公司)、50 mmol/L巰基乙醇(美國(guó)Sigma公司)，在37℃ (95%相對(duì)濕度，5% CO2)下培養(yǎng)。

人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，在37℃(95%相對(duì)濕度，5% CO2)下培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞按照5×104/孔密度鋪在24孔內(nèi)，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體時(shí)，換成無(wú)雙抗培養(yǎng)基，用lipo2000 (英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)進(jìn)行載體轉(zhuǎn)染。

1.3 外源基因的電轉(zhuǎn)化

使用Neon Transfection System電轉(zhuǎn)化儀器(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)進(jìn)行抗體的電轉(zhuǎn)。對(duì)目的細(xì)胞用lipo2000轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體，48 h后，將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)。取106個(gè)細(xì)胞吸取120 μL R液重懸，同時(shí)加入2.5 μg抗體，輕輕混勻，電極外槽中加入E2液。設(shè)置1100 V 30 ms 2 pulse，將電轉(zhuǎn)槍頭插入外槽中，點(diǎn)擊開始，結(jié)束后重新將細(xì)胞鋪到孔板中，在Delta Vision高分辨率成像顯微鏡(美國(guó)通用電氣公司)下進(jìn)行觀察。

1.4 PI-Annexin V染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

INS1細(xì)胞過(guò)表達(dá)基因48 h后，經(jīng)PBS清洗、胰酶消化、PBS重懸后計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，混勻后再加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，加入10 μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育20 min，期間混勻2~3次，20 min后上機(jī)檢測(cè)。數(shù)據(jù)結(jié)果用軟件GraphPad Prism v.7.0進(jìn)行差異顯著性分析。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)

電轉(zhuǎn)抗體4 h后，在RIPA (細(xì)胞強(qiáng)裂解液)中添加PMSF (蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞并收集裂解液。用BCA (上海碧云天公司)測(cè)量蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后，加入等量蛋白(可用1×上樣緩沖液補(bǔ)齊)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，5%封閉液37℃封閉1 h，hIAPP一抗(武漢三鷹公司，cat# 22305-1-AP) 1:500 4℃孵育過(guò)夜；copGFP一抗(美國(guó)Origene公司，cat# TA150041) 1:1000 37℃孵育1 h；Actin一抗(美國(guó)Sigma Aldrich公司, cat# A5441) 1:5000 37℃孵育1 h；二抗(美國(guó)Thermo Fisher公司) 1:3000 37℃孵育1 h。抗體剝離時(shí)將膜置于剝離液中，52℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。用ECL試劑(上海天能公司)檢測(cè)目的蛋白免疫反應(yīng)條帶，使用軟件Image J進(jìn)行蛋白條帶灰度分析以及用軟件GraphPad Prism v.7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)檢測(cè)凋亡及胰島素分泌相關(guān)基因表達(dá)量

過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后，用RNAiso Plus (寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用One-Step gDNA Removal試劑盒(北京全式金公司)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入Green qPCR SuperMix (北京全式金公司)，用定量PCR儀(瑞士Roche公司)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因如、，以及胰島素分泌相關(guān)基因如、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由吉林庫(kù)美生物公司合成，qPCR擴(kuò)增引物序列見表1。數(shù)據(jù)用軟件GraphPad Prism v.7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.7 葡萄糖刺激胰島素分泌

在經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)化抗體入細(xì)胞，細(xì)胞恢復(fù)48 h后，用KRB (Krebs–Ringer bicarbonate buffer)緩沖液孵育細(xì)胞30 min，然后用2.8或16.7 mmol/L葡萄糖在37℃下刺激1 h。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用胰島素ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所公司)利用酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)測(cè)定胰島素含量。將細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，胰島素含量數(shù)據(jù)利用總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行校正，用軟件GraphPad Prism v.7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.8 剛果紅染色

采用剛果紅檢測(cè)hIAPP[20]，PBS洗滌后，INS1細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛孵育15 min，用0.2% Triton-X 100打孔5 min。用無(wú)水酒精配置1.2%的剛果紅染液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為13.57，加入適量剛果紅染液于細(xì)胞培養(yǎng)板中，室溫下孵育20 min，用PBS洗去多余的染液。鏡下觀察后使用軟件Image J進(jìn)行染色強(qiáng)度分析，軟件Graphpad prism 7整理數(shù)據(jù)得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.9 藥物處理

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h，添加藥物處理。按照20 μmol/L凋亡抑制劑Z-VAD-FMK和1 μmol/L壞死抑制劑NSA (美國(guó)Selleck Chemicals公司)的濃度，先將各藥品加到50 μL新鮮培養(yǎng)基中，混合均勻后再分別添加到細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，輕輕搖晃混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)。DMSO用作陰性對(duì)照。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果均采用GraphPad Prism v.7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，每組數(shù)據(jù)包含3次或以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇兩組樣本的“unpaired two-tailed Student's-test”或多組樣本的“one-way ANOVA”算法進(jìn)行差異顯著性分析，<0.05被視為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 hIAPP累積對(duì)INS1細(xì)胞的毒性作用

向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hIAPP，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)效率達(dá)到2000倍(圖1A)，同時(shí)剛果紅染色表明hIAPP在細(xì)胞內(nèi)聚集(圖1B)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)后剛果紅染色強(qiáng)度增強(qiáng)2.25倍(圖1C)。轉(zhuǎn)染后72 h，INS1細(xì)胞活力降低，顯微鏡下可直接觀察到細(xì)胞密度和數(shù)目明顯減少(圖1D)，CCK8檢測(cè)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖能力(圖1E)。此外，過(guò)表達(dá)后檢測(cè)LDH的釋放量增加1.33倍，表明其積累對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷(圖1F)。通過(guò)PI染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖1，G和H)得出，在添加凋亡抑制劑Z-VAD-FMK和壞死抑制劑NSA后，PI染色陽(yáng)性率細(xì)胞減少，說(shuō)明抑制劑可以部分回復(fù)細(xì)胞死亡表型，同時(shí)表明hIAPP累積引起的細(xì)胞死亡包括凋亡和壞死兩種類型。通過(guò)直接觀察細(xì)胞形態(tài)(圖1I)及CCK8檢測(cè)(圖1J)細(xì)胞活性，可以觀察到添加Z-VAD-FMK組細(xì)胞數(shù)目明顯增多、細(xì)胞活性增強(qiáng)，表明Z-VAD-FMK對(duì)細(xì)胞活性的回復(fù)程度比NSA大，說(shuō)明細(xì)胞凋亡是hIAPP累積引起的細(xì)胞死亡主要類型。綜上所述，的過(guò)表達(dá)抑制INS1細(xì)胞的增殖，hIAPP的累積對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生毒性，并主要通過(guò)凋亡引起細(xì)胞死亡。

2.2 Trim-Away系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證

本研究首先在HepG2和INS1細(xì)胞系中驗(yàn)證Trim- Away系統(tǒng)的可行性。分別擴(kuò)增人和大鼠，連接到pcDNA3.1載體上，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，lv3基礎(chǔ)載體用于過(guò)表達(dá)，copGFP綠色熒光蛋白用于待敲除蛋白，載體示意圖見圖2A。在HepG2或INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Trim21及l(fā)v3-copGFP載體，顯微鏡下觀察。HepG2細(xì)胞中電轉(zhuǎn)入copGFP抗體20 min后，熒光強(qiáng)度開始變化，在40 min內(nèi)顯著下降達(dá)50%，4 h后熒光基本消失(圖2B)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而下降，4 h時(shí)降到最低(圖2C)。在INS1細(xì)胞中也觀察到類似的copGFP降解，并且在轉(zhuǎn)入抗體24 h及48 h后，copGFP的熒光仍處于部分消失的情況(圖2D)，說(shuō)明Trim-Away系統(tǒng)降解目的蛋白且能維持一段時(shí)間。因此，本研究成功地建立了Trim-Away系統(tǒng)，并在HepG2和INS1細(xì)胞中表現(xiàn)出快速、高效的性能。

2.3 Trim-Away系統(tǒng)減少hIAPP的累積

為了確定Trim-Away系統(tǒng)是否可以通過(guò)降解hIAPP來(lái)減少其毒性，本研究首先通過(guò)直接觀察hIAPP-copGFP融合蛋白的熒光變化來(lái)檢測(cè)其降解效率。在過(guò)表達(dá)大鼠和(載體示意圖見圖2A和圖3A)的INS1細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)入hIAPP抗體后，觀察到hAPP-copGFP的熒光幾乎全部淬滅(圖3B)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度顯著下降 83% (圖3C)，表明hIAPP抗體結(jié)合并降解了hIAPP- copGFP融合蛋白。Western blot檢測(cè)hIAPP和copGFP蛋白水平，結(jié)果表明，hIAPP和copGFP蛋白表達(dá)水平均明顯減少(圖3D)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也驗(yàn)證了hIAPP-copGFP融合蛋白含量減少50% (圖3，E和F)。這表明hIAPP抗體、hIAPP-copGFP和rTrim21被募集到泛素蛋白酶體中并被降解?？紤]到hIAPP- copGFP融合蛋白可能會(huì)影響Trim-Away的敲除效率，隨后將pcDNA3.1-rTrim21過(guò)表達(dá)載體和無(wú)標(biāo)簽的pcDNA3.1-hIAPP過(guò)表達(dá)載體(載體構(gòu)建示意圖見圖2A和圖3A)轉(zhuǎn)入INS1細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)hIAPP蛋白表達(dá)水平(圖3，G和H)，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)入hIAPP抗體后外源hIAPP蛋白表達(dá)水平減少92%，此外與NC組對(duì)比，內(nèi)源性的IAPP也有70%被降解。利用Trim-Away系統(tǒng)清除hIAPP時(shí)，加入IgG作為hIAPP抗體的對(duì)照，Western blot檢測(cè)hIAPP蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，加入IgG抗體組的hIAPP蛋白表達(dá)水平并未改變(圖3I)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖3J)，IgG抗體并未對(duì)hIAPP造成明顯影響，也說(shuō)明該系統(tǒng)嚴(yán)格進(jìn)行了抗體與目標(biāo)蛋白間的特異結(jié)合。

圖1 hIAPP累積對(duì)INS1細(xì)胞的毒性作用

A：qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)。B、C：剛果紅染色及染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)過(guò)表達(dá)后的積累情況。D：顯微鏡下觀察過(guò)表達(dá)后INS1細(xì)胞形態(tài)變化。E：CCK8檢測(cè)過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞活力。F：檢測(cè)過(guò)表達(dá)后細(xì)胞LDH的釋放量。G：顯微鏡下觀察過(guò)表達(dá)及加入抑制劑后PI染色結(jié)果。其中紅色為PI陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核。H：PI染色統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。I：顯微鏡下觀察加入抑制劑后細(xì)胞的形態(tài)變化。J：CCK8檢測(cè)加入抑制劑后細(xì)胞的活性。B、G 圖中標(biāo)尺為100 μm，D、I圖中標(biāo)尺為50 μm；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001；A~F圖中NC表示轉(zhuǎn)入pcDNA3.1空白載體作為陰性對(duì)照，G~J圖中NC表示轉(zhuǎn)入pcDNA3.1空白載體后加入等體積DMSO作為陰性對(duì)照。

圖2 Trim-Away系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證

A：Trim-Away系統(tǒng)載體示意圖。B：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后HepG2細(xì)胞在兩個(gè)不同視野下copGFP的熒光強(qiáng)度變化。C：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后HepG2細(xì)胞中不同視野下檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化統(tǒng)計(jì)。不同顏色的6條折線表示所統(tǒng)計(jì)的6個(gè)不同視野隨時(shí)間變化(橫坐標(biāo))而降低的熒光強(qiáng)度(縱坐標(biāo))。D：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)24 h及48 h后顯微鏡下觀察INS1細(xì)胞中copGFP的熒光變化。圖中標(biāo)尺為20 μm。

2.4 Trim-Away系統(tǒng)改善hIAPP誘導(dǎo)的INS1細(xì)胞死亡

如前所述，Trim-Away系統(tǒng)可以有效減少hIAPP的積累，因此推測(cè)該系統(tǒng)能對(duì)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的INS1細(xì)胞毒性起到改善作用。在向過(guò)表達(dá)的INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入hIAPP抗體后細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生顯著恢復(fù)(圖4A)；同樣，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)入抗體能有效回復(fù)過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞活力下降(圖4B)。與CCK8結(jié)果一致，hIAPP抗體轉(zhuǎn)入后，LDH的釋放量下降至與對(duì)照組相同(圖4C)，進(jìn)一步證實(shí)了Trim-Away系統(tǒng)可以減弱hIAPP對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。這些結(jié)果表明，Trim-Away系統(tǒng)有效地抑制了hIAPP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。由于凋亡是hIAPP誘導(dǎo)的INS1細(xì)胞死亡的主要類型，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。Annexin V-FITC單陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是晚期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞(圖4D)。結(jié)果顯示，Trim-Away系統(tǒng)可減少早期凋亡(由24.2%下調(diào)為14.9%)和晚期凋亡細(xì)胞(由12.2%下調(diào)為8.87%) (圖4，E和F)。此外，本研究還利用qPCR檢測(cè)了抗凋亡因子和促凋亡因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。當(dāng)過(guò)表達(dá)時(shí)，表達(dá)升高，表達(dá)降低，比值升高(圖4，G和H)，表示細(xì)胞有發(fā)生凋亡的傾向，與圖1G檢測(cè)到的凋亡表型現(xiàn)象一致。在Trim-Away系統(tǒng)降低hIAPP積累水平后，比值回復(fù)(圖4，G和H)。這些結(jié)果證明，Trim-Away系統(tǒng)靶向hIAPP的積累減少細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)作用。

圖3 Trim-Away系統(tǒng)減少hIAPP的累積

A：過(guò)表達(dá)載體示意圖。B：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后INS1細(xì)胞中hIAPP-copGFP融合蛋白的熒光變化。C：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后熒光強(qiáng)度變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D：Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后hIAPP-copGFP蛋白的表達(dá)水平。E、F：copGFP和hIAPP蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果。G：Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后hIAPP蛋白的表達(dá)水平。H：G圖中hIAPP蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果。I：Western blot檢測(cè)IgG作為hIAPP抗體對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件下hIAPP的蛋白表達(dá)水平；J：I圖中hIAPP蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。B，C圖中OE表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-rTrim21及l(fā)v3-hIAPP-copGFP，H圖中OE表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-rTrim21及pcDNA3.1-hIAPP，OE+抗體表示過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)入hIAPP抗體，應(yīng)用Trim-Away系統(tǒng)；圖中標(biāo)尺為20 μm；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

圖4 Trim-Away系統(tǒng)可改善hIAPP誘導(dǎo)的INS1細(xì)胞死亡

A：顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后INS1細(xì)胞數(shù)目的變化。B：CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后的細(xì)胞活性。C：轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后檢測(cè)LDH的釋放量。D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI-Annexin V染色的結(jié)果。E，F(xiàn)：D圖中早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。G，H：qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后和mRNA的相對(duì)表達(dá)量。圖中NC表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-rTrim21及pcDNA3.1空白載體作為陰性對(duì)照，OE表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-rTrim21及pcDNA3.1-hIAPP，OE+抗體表示過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)入hIAPP抗體，應(yīng)用Trim-Away系統(tǒng)；標(biāo)尺為50 μm；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001；：>0.05。

2.5 Trim-Away系統(tǒng)可減輕hIAPP累積對(duì)β細(xì)胞功能的損害

正常情況下，hIAPP與胰島素共同分泌，hIAPP的過(guò)量或錯(cuò)誤折疊會(huì)導(dǎo)致其在細(xì)胞膜內(nèi)外積累和聚集，引起細(xì)胞毒性，影響β細(xì)胞分泌胰島素。本研究使用剛果紅染色檢測(cè)hIAPP的積累，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)組較對(duì)照組hIAPP染色強(qiáng)度下降，說(shuō)明減少了hIAPP的聚集(圖5，A和B)。此外，qPCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組β細(xì)胞分泌胰島素的相關(guān)基因如和的表達(dá)量減少，但Trim-Away系統(tǒng)轉(zhuǎn)入后可以回復(fù)這些基因的表達(dá)水平(圖5C)。隨后，用ELISA試劑盒檢測(cè)胰島素的分泌能力，結(jié)果顯示Trim- Away系統(tǒng)也回復(fù)了hIAPP抑制的胰島素分泌(圖5D)。這些結(jié)果表明，hIAPP累積會(huì)抑制胰島素分泌，而Trim-Away系統(tǒng)通過(guò)減少hIAPP的積累減輕了β細(xì)胞功能的損傷。

圖5 Trim-Away系統(tǒng)可減輕hIAPP累積對(duì)β細(xì)胞功能的損害

A：顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后剛果紅染色結(jié)果。B：剛果紅染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。C：qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后等胰島素分泌相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量變化。D：ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)入Trim-Away系統(tǒng)后的胰島素分泌量變化。NC表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-rTrim21及pcDNA3.1空白載體作為陰性對(duì)照，OE表示向INS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了pcDNA3.1-rTrim21及pcDNA3.1-hIAPP，OE+抗體表示過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)入hIAPP抗體，應(yīng)用Trim-Away系統(tǒng)；標(biāo)尺為100 μm；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001；：>0.05。

3 討論

在人()、貓()和非靈長(zhǎng)類動(dòng)物中 IAPP 的累積會(huì)導(dǎo)致糖尿病，但在嚙齒類動(dòng)物中不會(huì)導(dǎo)致糖尿病。已有研究報(bào)道IAPP在人、小鼠()、大鼠、貓和豚鼠()體內(nèi)的20~29位氨基酸殘基在不同物種間存在差異[21,22]，這可能是在人類、貓和非靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)外聚集而在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)不存在的原因。本研究利用大鼠胰島素瘤細(xì)胞INS1過(guò)表達(dá)人源進(jìn)行研究，證實(shí)過(guò)量的hIAPP可導(dǎo)致INS1細(xì)胞死亡，損害細(xì)胞功能。大鼠與人的IAPP蛋白除20~29位氨基酸不同外，其余氨基酸序列相似性很高，本研究所用抗體也可以識(shí)別INS1細(xì)胞中表達(dá)的rIAPP，如圖3中Western blot結(jié)果顯示對(duì)照組中出現(xiàn)hIAPP條帶也屬正常。由于INS1中不表達(dá)hIAPP，所以在轉(zhuǎn)入hIAPP過(guò)表達(dá)載體后，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示高倍數(shù)的過(guò)表達(dá)效率(圖1A)。

淀粉樣變性是淀粉樣物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)造成沉積，使細(xì)胞功能受損的一種臨床癥狀。其特征有蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，或淀粉樣纖維的嚴(yán)重累積。研究表明許多疾病都與淀粉樣變性相關(guān)，例如hIAPP與T2DM[23]，淀粉樣β肽(Aβ)、Tau蛋白與阿爾茨海默癥(Alzheimer disease, AD)[24,25]以及朊蛋白(PrP)與海綿狀腦病[26]等。其中hIAPP一般先形成毒性寡聚體，α螺旋結(jié)構(gòu)增多，能夠穿透細(xì)胞膜，然后進(jìn)一步聚集形成成熟纖維，以β折疊結(jié)構(gòu)為主，在細(xì)胞內(nèi)外累積[27]。多種淀粉樣蛋白聚集小分子抑制劑多為多酚類化合物，其中咖啡酸和綠原酸可以延緩α螺旋向β折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，并改變hIAPP最終形態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；水飛薊賓可與hIAPP疏水表面結(jié)合抑制其聚集；丹酚酸B延緩α螺旋向β折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[28]。小分子抑制劑多是從中藥或其他植物提取，因?yàn)槿梭w產(chǎn)生hIAPP累積是個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，日常攝入可以有效減少hIAPP的聚集，但是這些藥物其他成分的長(zhǎng)期攝入是否會(huì)產(chǎn)生副作用還未知。并且多酚類小分子的透膜性很差，目前還未很好解決[29]。此外小分子抑制劑的抑制作用主要依靠芳香烴結(jié)構(gòu)，是否會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他類似結(jié)構(gòu)的化合物產(chǎn)生不利影響目前還不清楚，但抗體的特異性能很大程度地降低這些潛在的影響。一些自行設(shè)計(jì)并合成的短肽類也可以抑制淀粉樣蛋白沉積，如短肽FLPNF可以通過(guò)增強(qiáng)腦啡肽酶活性進(jìn)而抑制hIAPP聚集[30]，但是增強(qiáng)腦啡肽酶活性是否會(huì)對(duì)多種肽類底物水解造成影響目前還不清楚。

應(yīng)用CRISPR/Cas9、RNAi等技術(shù)可以在DNA或RNA水平上降低的表達(dá)，但這些技術(shù)降低其表達(dá)的同時(shí)也會(huì)抑制其正常生理功能，產(chǎn)生非特異性的缺陷，因此這些技術(shù)不適合清除已經(jīng)合成的蛋白質(zhì)[31]。Trim-Away利用抗體特異性和胞內(nèi)泛素蛋白酶體系統(tǒng)去除過(guò)量的hIAPP蛋白，將對(duì)細(xì)胞其他成分產(chǎn)生的不良影響降到最低，并能正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。另外Trim-Away系統(tǒng)可以在60 min內(nèi)降解80%左右的蛋白水平，比傳統(tǒng)的敲除技術(shù)快得多。因此，該技術(shù)在提高細(xì)胞活力和改善胰島素產(chǎn)生功能方面表現(xiàn)出良好的性能。

由于現(xiàn)在的培養(yǎng)技術(shù)尚不支持本研究對(duì)人類胰腺β細(xì)胞進(jìn)行離體平面培養(yǎng)，所以本研究選擇在大鼠細(xì)胞中進(jìn)行模擬。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)定會(huì)對(duì)清除人β細(xì)胞里hIAPP累積有所幫助。在實(shí)際臨床運(yùn)用中最大的問(wèn)題是如何將hIAPP抗體在需要的時(shí)候引入患者體內(nèi)并靶向胰島細(xì)胞。目前，通過(guò)轉(zhuǎn)入特異性抗體的cDNA在小鼠、牛、家蠶等生物體內(nèi)表達(dá)抗體的技術(shù)已經(jīng)比較成熟[32,33]?？梢岳孟俨《菊T導(dǎo)特定細(xì)胞表達(dá)特異性抗體Fc結(jié)構(gòu)域，克服長(zhǎng)期引入抗體的限制。此外，應(yīng)用納米技術(shù)或其他科技手段可以加載hIAPP抗體，并能根據(jù)胰島細(xì)胞的特異性標(biāo)志物靶向胰島細(xì)胞。而且針對(duì)內(nèi)源性hIAPP的特異性抗體已經(jīng)被研發(fā)出來(lái)，可以區(qū)別前體hproIAPP及成熟的hIAPP、寡聚及聚集的、纖維狀和非纖維狀的hIAPP，所以精確調(diào)控內(nèi)源性hIAPP指日可待。綜上所述， Trim-Away技術(shù)可以改善由于hIAPP累積而對(duì)β細(xì)胞產(chǎn)生的毒性及功能損傷，為β細(xì)胞功能損傷導(dǎo)致的2型糖尿病提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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Toxicity reduction of human islet amyloid polypeptide by Trim-Away technique in insulinoma cells

Jiawei Gong, Delin Kong, Lin Yang, Yuzhe Nie, Yang Liang, Chun-Bo Teng

Human islet amyloid polypeptide (hIAPP, also known as amylin) is a co-secreting protein of insulin in human pancreatic β-cells. It is encapsulated in vesicles and secreted out of the cells with insulin. hIAPP can promote insulin secretion and regulate blood glucose homeostasis in the body under the normal physiological conditions. However, hIAPP misfolding or excessive accumulation can cause toxic effects on the β cells, which in turn affect cell function, resulting in type 2 diabetes mellitus (T2DM) for the affected individuals. In order to eliminate the excessive accumulation of hIAPP in the cell and to maintain its normal synthetic function, we have adopted a new protein degradation technology called Trim-Away, which can degrade the target protein in a short time without affecting the mRNA transcription and translation synthesis function of the target protein. First, we overexpressed hIAPP in the rat insulinoma cells (INS1) to simulate its excessive accumulation and analyzed its effect in INS1 cells by measuring the release of LDH (lactate dehydrogenase), CCK8 activity and PI-Annexin V positive ratio. Results showed that excessive accumulation of hIAPP caused β cell apoptosis. Second, real-time quantitative PCR analysis and ELISA detection showed that the synthesis and secretion of insulin were hindered. We used Trim-Way technology to specifically eliminate the excessive accumulation of hIAPP protein in hIAPP overexpressing INS1 cells. Cell activity experiments confirmed that clearance of hIAPP reduced the cell death phenotype. Further ELISA experiments confirmed that INS1 cells restored insulin secretion ability. This study examined the toxic effect of hIAPP excessive accumulation in INS1 cells and demonstrated the cyto-toxicity clearance effect of Trim-Way technology in pancreatic β-cells. Our research has provided a new strategy for using Trim-Away technology for treatment of diabetes.

Trim-Away; human islet amyloid polypeptide (hIAPP); β-cell; insulin secretion

2020-03-07;

2020-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31472159)和黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：ZD2017001)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31472159), and the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (No. ZD2017001)]

龔葭薇，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: 869268764@qq.com

滕春波，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: chunboteng@nefu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-061

2020/6/10 10:06:43

URI: kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200609.1526.002.html

(責(zé)任編委: 陳雁)