PPARγ基因多態(tài)性與中國北方人群散發(fā)性帕金森病相關(guān)性分析

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

帕金森病(PD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，可能是由于黑質(zhì)紋狀體分泌的多巴胺減少導(dǎo)致[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)作為甾體類激素受體超家族成員之一,在腦基底節(jié)區(qū)和一些多巴胺受體的表達(dá)部位均有分布[2]，這一現(xiàn)象暗示PPARγ和PD可能存在某種關(guān)聯(lián)。PD動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，PPARγ激動(dòng)劑具有保護(hù)神經(jīng)元免受損傷的功能[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)基因的多態(tài)性與PD的易感性密切相關(guān)[4]，但PPARγ基因多態(tài)性與PD相關(guān)性的研究較少，且性別、年齡、地域以及種族等因素均會對疾病的易感性產(chǎn)生影響，因此，本研究通過對PD患者年齡、性別的分層分析，探討PPARγ基因多態(tài)性對中國北方人群散發(fā)性PD易感性的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017—2019年于我院神經(jīng)內(nèi)科門診確診為PD的患者(PD組)391例， 患者均符合英國PD腦庫的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且為居住于北方地區(qū)的漢族人群；同時(shí)排除有血管源性帕金森綜合征、腦外傷、腦膜腦炎及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史者，排除PD家族病史者；選取同期健康查體者(對照組)391例，對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡、性別與PD組相匹配；居住于北方地區(qū)的漢族人群；無PD家族病史。PD組男206例，女185例，平均年齡為(62.42±9.32)歲；對照組男213例，女178例，平均年齡為(61.08±10.16)歲。兩組間年齡和性別比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。同時(shí)再按照年齡和性別進(jìn)行亞組分組，PD組中發(fā)病年齡≤50歲者為早發(fā)性PD組(B1組)，>50歲者為晚發(fā)性PD組(B2組)；B1組和B2組再分別按照性別分為男B1組(B1-1組)、女B1組(B1-2組)、男B2組(B2-1組)、女B2組(B2-2組)；對照組按照同樣的分組方法進(jìn)行分組，分為A1～2組及A1-1～B2-2組。所有研究對象本人或家屬均簽署知情同意書，并獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)(QYFYWZLL25594)。

1.2 DNA提取及基因型檢測

空腹采集兩組研究對象的外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用北京天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒(DP318)提取DNA,產(chǎn)物置于冰箱中-20 ℃保存。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6-7],應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)檢測研究對象的基因分型。PCR總體系為25 μL, 包括基因組DNA2.5 μL， TaqDNA聚合酶12.5 μL，前后的引物各0.5 μL及雙蒸水9 μL。PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)引物序列為F: 5′-GCCAATTCAAGCCCAGTC-3′,R:5′-GATATGTTTGCAGACAGTGTATCA-GTGAAGGAATCGCTTTCCG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min,最后4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)BstUⅠ(紐英倫生物技術(shù)北京有限公司)60 ℃孵育過夜。PPARγ基因rs3856806位點(diǎn)引物序列為F:5′-AGGTTTGCTGAATGTGAAGC-3′，R:5′-GGTGAA-GACTCATGTCTGT-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，57.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min,最后4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaAⅠ(紐英倫生物技術(shù)北京有限公司)60 ℃過夜孵育。兩位點(diǎn)酶切后產(chǎn)物于25 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，進(jìn)行成像分析確定基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以Hardy-Weinberg平衡定律評估所有受試者是否具有代表性，兩組間年齡比較采用t檢驗(yàn)，性別、基因型和等位基因頻率分布在兩組間差異采用χ2分析，采用Haploview 4.2軟件對PPARγ基因 rs1801282以及rs3856806兩個(gè)位點(diǎn)的單體型頻率及是否連鎖不平衡進(jìn)行分析，以r2>0.33認(rèn)為兩位點(diǎn)存在連鎖不平衡，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 性別、年齡對PPARγ基因多態(tài)性的影響

rs1801282和rs3856806位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。B1與A1組rs1801282位點(diǎn)等位基因頻率比較差異有顯著性，攜帶G等位基因可能會增加早發(fā)性PD的易感性(χ2=7.953,P<0.05,OR=11.170,95%CI=1.403～88.911)；B1-1組與A1-1組等位基因頻率分布比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.630,P<0.05,OR=1.123,95%CI=1.030～1.223)。見表1。B1組與A1組、B1-1組與A1-1組、B1-2組與A1-2組、B2組與A2組、B2-1組與A2-1組、B2-2組與A2-2組rs3856805多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.2 PD組和對照組PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)和rs3856806位點(diǎn)單體型和連鎖不平衡分析

對PPARγ基因rs1801282和rs3856806位點(diǎn)進(jìn)行單體型和連鎖不平衡分析，PPARγ呈現(xiàn)基因多態(tài)性，兩位點(diǎn)間存在較弱連鎖不平衡(D′=0.678，r2=0.087)，PD組和對照組間C-C、C-T、G-T、G-C 4種單體型分布相比較差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 受試者rs1801282基因型頻率和等位基因頻率分布情況

表2 受試者rs3856806基因型頻率和等位基因頻率分布情況

表3 兩組間PPARγ單體型分布比較

3 討 論

研究顯示，PPARγ受體被激活后對PD會發(fā)揮保護(hù)作用。硫代巴比妥類化合物MDG548作為功能性PPARγ激動(dòng)劑，在PC12細(xì)胞中保護(hù)細(xì)胞免受H2O2氧化和1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)神經(jīng)毒性，在MPTP處理的小鼠中可減少其黑質(zhì)中的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞以及iNOS生成[8]。在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，羅格列酮可改善SOD、Bcl-2以及Bax的表達(dá)，保護(hù)線粒體免受MPP+引起的損傷[9]。此外，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮通過抑制6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD模型大鼠黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化,進(jìn)而抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[10]。

PPARγ基因位于染色體3p-25的位置[11]，此基因上的多態(tài)性位點(diǎn)可能與疾病的易感性有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)多態(tài)性可能與神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默(AD)易感性相關(guān)。意大利白種人群中攜帶G等位基因的80歲及以上老年人患AD的風(fēng)險(xiǎn)是對照組的2倍[12]。在對英國高加索人群的研究中發(fā)現(xiàn)，rs1801282位點(diǎn)的G等位基因?qū)ε訟D起保護(hù)作用，但在男性中作用相反[13]，提示這一位點(diǎn)的基因變異可能對男性和女性的作用機(jī)制不同。

由于性別、年齡、地域和種族等因素均會對疾病易感性產(chǎn)生影響，因此本研究通過年齡、性別亞組分析，進(jìn)一步明確不同因素對疾病的影響。在本研究中，對所有研究對象進(jìn)行年齡、性別亞組分析及單體型分析后，未發(fā)現(xiàn)rs3856806位點(diǎn)多態(tài)性在各組間

有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示rs3856806位點(diǎn)多態(tài)性可能對中國北方人群散發(fā)性PD的發(fā)生無影響，這與之前對日本及中國南方人群的調(diào)查結(jié)果一致[14-15]。本研究結(jié)果顯示，B1組及B1-1組中rs1801282位點(diǎn)G等位基因頻率分別高于A1組及A1-1組，表明G等位基因可能是中國北方人群早發(fā)性PD及男性早發(fā)性PD的危險(xiǎn)因素，提示遺傳因素可能對PD的發(fā)病時(shí)間有影響，且早發(fā)性PD對男性、女性的致病機(jī)制可能不同。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)rs1801282位點(diǎn)G等位基因可能會使PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄活性降低[16]，據(jù)此推測其可能使PPARγ受體表達(dá)水平下降，間接導(dǎo)致PPARγ對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用下降，使PD易感性增加。相關(guān)研究證實(shí)遺傳因素對早發(fā)性PD(發(fā)病年齡≤50歲)比晚發(fā)性PD(發(fā)病年齡>50歲)影響更為明顯[17]，本研究結(jié)果也再次驗(yàn)證這一結(jié)論。

綜上所述，兩位點(diǎn)所構(gòu)建的四種不同單體型與PD無相關(guān)性，且兩位點(diǎn)只存在較弱的連鎖不平衡,本研究首次揭示了PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)等位基因G可能會增加中國北方人群早發(fā)性PD及男性早發(fā)性PD的患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，本文研究可能會為未來PD的基因預(yù)測以及治療提供數(shù)據(jù)的支持。PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)與PD易感性相關(guān)的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。