PRRX1對(duì)乳腺癌多藥耐藥發(fā)生的影響及其機(jī)制

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺病診療中心，山東 青島 266003)

乳腺癌是目前發(fā)病率較高的腫瘤之一[1]。在乳腺癌的綜合治療中，化療占有十分重要的地位。但多藥耐藥(MDR)即癌細(xì)胞同時(shí)對(duì)不同藥物產(chǎn)生交叉耐藥性仍然是化療成功的主要障礙[2]。在MDR的眾多原因中，由MDR1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達(dá)發(fā)揮著重要作用，可在藥物到達(dá)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)前即被攔截和排出胞外[3]。P-gp的過表達(dá)也會(huì)使乳腺癌細(xì)胞對(duì)治療中的許多常用藥物產(chǎn)生耐藥性，如蒽環(huán)類、紫杉類、長(zhǎng)春堿類藥物等[4]。因此，逆轉(zhuǎn)MDR、提高患者的化療療效成為乳腺癌治療中最大的挑戰(zhàn)之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程。發(fā)生EMT的細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間連接松散，并伴隨EMT標(biāo)記物如N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)表達(dá)的改變[5]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，這是

腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制[6]。配對(duì)相關(guān)同源框1(PRRX1)已被證實(shí)為一個(gè)新的EMT的誘導(dǎo)因子，可使乳腺癌[7]、大腸癌[8]、胰腺癌[9]、胃癌[10]和頭頸癌[11]等腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。其過表達(dá)可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移性和侵襲性[12]，但其在乳腺癌MDR中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討EMT誘導(dǎo)因子PRRX1在乳腺癌MDR中的作用及其分子機(jī)制，并為乳腺癌治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分組及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，將細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)并置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以后分離接種于24孔板中，細(xì)胞按照處理方法不同分為3組，未處理的MCF-7細(xì)胞作為空白對(duì)照組(A組)，轉(zhuǎn)染空白pEX-3載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)的MCF-7細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(B組)，轉(zhuǎn)染攜帶PRRX1基因的重組質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)的MCF-7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(C組)。B、C組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d更換培養(yǎng)基，使用Lipofecta-mine 2000(美國(guó)Iivitrogen公司)試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染情況。收集3組細(xì)胞(約9×105個(gè)/孔)用于后續(xù)相關(guān)基因和蛋白分析測(cè)定。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)各組細(xì)胞當(dāng)中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp mRNA的表達(dá)

從3組MCF-7細(xì)胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后采用Gene Amp 2400 PCR儀(美國(guó)PE公司)進(jìn)行RT-qPCR。RT-qPCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；然后98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后95 ℃延伸1 min。以β-Actin作為內(nèi)參基因，使用2-△△CT方法計(jì)算各組細(xì)胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gpmRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3 WES蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp蛋白的表達(dá)

以蛋白裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白以后，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將不同組別蛋白質(zhì)溶液調(diào)成相同濃度。依照說明書將Ladder加入WES試劑盒檢測(cè)板第一行第1孔，其余24孔依次循環(huán)加入3組等濃度蛋白質(zhì)溶液，第2行加入抗體稀釋液，第3行加入β-Actin、PRRX1、N-cadherin、Vimentin及P-gp一抗，第4行加入與各一抗對(duì)應(yīng)的二抗，第5行加入發(fā)光液，最后加入緩沖液。離心并上機(jī)操作，運(yùn)行完成后采用Compass軟件分析目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組MCF-7細(xì)胞(4 000個(gè)/孔)接種于96孔板中。細(xì)胞貼壁后加入化療藥物多西他賽和順鉑(北京索萊寶科技有限公司)。多西他賽的最終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 μmol/L，順鉑的最終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 μmol/L。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，未加藥的孔作為對(duì)照孔，加不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基的孔為調(diào)零孔。加入藥物24 h后，每孔添加CCK-8試劑10 μL混合后，再放回培養(yǎng)箱孵育1 h，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔吸光度值。用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算各組細(xì)胞的IC50。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況

倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，A組未見熒光(圖1A)，B組和C組均可見綠色熒光(圖1B、C)，轉(zhuǎn)染效率約為80%。A組和B組的細(xì)胞間均連接緊密，呈“鋪路石”狀(圖1D、E)，而C組細(xì)胞間連接松散，呈“紡錘形”(圖1F)。

2.2 各組細(xì)胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白表達(dá)情況

3組細(xì)胞中的PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gpmRNA及蛋白表達(dá)水平比較差異均具有顯著性(F=7.08～23.39，P<0.05)。其中C組上述4種因子的 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于A、B兩組(t=3.02～10.92，P<0.05)，A、B兩組比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 各組細(xì)胞多西他賽和順鉑處理后的IC50

多西他賽對(duì)A、B、C組細(xì)胞的IC50分別為0.45±0.06、0.44±0.06、1.29±0.14，順鉑對(duì)A、B、C組細(xì)胞的IC50分別為0.60±0.07、0.59±0.11、1.73±0.23，兩種藥物對(duì)3組細(xì)胞的IC50比較差異均具有顯著性(F=26.84、7.081，P<0.01)；其中兩種藥物對(duì)C組細(xì)胞的IC50明顯高于A、B兩組(t=4.54～5.68，P<0.05)；而兩種藥物對(duì)A、B組細(xì)胞的IC50比較差異無顯著性(P>0.05)。

A～C：A～C組細(xì)胞,熒光，200倍；D～F：A～C組細(xì)胞,普通光，200倍

表2 各組細(xì)胞PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

化療是乳腺癌最重要的治療手段之一，但由于患者易出現(xiàn)MDR而嚴(yán)重降低藥物療效，致使患者病情復(fù)發(fā)和預(yù)后不佳。逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR對(duì)提高乳腺癌的治療效果至關(guān)重要，也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注的熱點(diǎn)[13-14]。

大量研究表明，EMT與化療藥物的耐藥有著密切的關(guān)系[15-17]。在EMT過程中，維持上皮表型的重要黏附分子被間質(zhì)表型分子如N-Cadherin及vimentin所取代，從而導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性降低，細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)[18]。N-cadherin和vimentin不僅僅是EMT的重要標(biāo)志物，目前發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的MDR也具有密切關(guān)系[19]。FISCHER等[20]研究顯示EMT可通過激活乳腺癌細(xì)胞中的乙醛脫氫酶來誘導(dǎo)其對(duì)環(huán)磷酰胺耐藥。SAXENA等[21]也發(fā)現(xiàn)EMT誘導(dǎo)物不僅可以增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性，還可通過上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，增加化療藥物的外排而致使耐藥的發(fā)生。LI等[22]發(fā)現(xiàn)阿霉素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生EMT和MDR，并且只有發(fā)生EMT的細(xì)胞侵襲性會(huì)增加并出現(xiàn)MDR，抑制EMT可逆轉(zhuǎn)其MDR。PRRX1是一種新發(fā)現(xiàn)的EMT誘導(dǎo)因子，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT并增加其侵襲性[7]。在乳腺癌中，PRRX1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及患者5年生存率顯著相關(guān)[23]。LV等[24]研究結(jié)果顯示PRRX1的主要亞型之一PRRX1b在三陰性乳腺癌中顯著上調(diào)，并與腫瘤大小和周圍血管的侵犯程度相關(guān)。PRRX1b的沉默可抑制基底樣癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，PRRX1過表達(dá)可使乳腺癌MCF-7細(xì)胞系發(fā)生EMT改變，細(xì)胞間連結(jié)松散，細(xì)胞呈紡錘形，利于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移，并伴隨間質(zhì)表型標(biāo)志分子N-cadherin和vimentin表達(dá)的增加，這與先前的研究結(jié)果相符[5，7]。

然而PRRX1在MDR中的作用尚不清楚。最近的研究表明PRRX1高表達(dá)可誘導(dǎo)大腸癌EMT，與其轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良及放療耐受相關(guān)[8，25]。而在肺癌細(xì)胞中沉默PRRX1可誘導(dǎo)EMT并增加肺癌細(xì)胞抗凋亡能力和對(duì)順鉑的耐藥性[26-27]。上述研究提示PRRX1在不同類型的癌癥細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用。本研究結(jié)果亦顯示，用多西他賽和順鉑分別處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞24 h后，C組細(xì)胞的IC50值明顯高于A組和B組，提示PRRX1過表達(dá)可致使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生MDR。在腫瘤細(xì)胞系中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)可增加藥物外排從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，是腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性最主要的機(jī)制之一[28-29]。由MDR1基因編碼的P-gp，又稱ABCB1，是研究最深入的ABC蛋白，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是克服腫瘤MDR的重要靶點(diǎn)[30]。P-gp不僅介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的MDR，而且參與調(diào)節(jié)其增殖、凋亡、遷移、侵襲及EMT等[31]。本研究通過RT-qPCR和WES蛋白定量分析系統(tǒng)檢測(cè)了3組細(xì)胞中P-gpmRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示C組細(xì)胞的P-gpmRNA及蛋白表達(dá)水平較A、B兩組均明顯增高，提示PRRX1可能通過上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，介導(dǎo)MDR的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)PRRX1過表達(dá)可通過誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞EMT而致使其發(fā)生MDR，對(duì)乳腺癌MDR發(fā)生機(jī)制的研究提供了新的思路。但MDR機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，PRRX1參與這一過程的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。