2,3-吲哚醌對(duì)乳腺癌BT549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021； 2 中山大學(xué)腫瘤防治中心神經(jīng)外科； 3 青島大學(xué)藥學(xué)院)

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因。乳腺癌的不同分子亞型與其治療效果和預(yù)后密切相關(guān)，臨床上，根據(jù)受體表達(dá)情況，大致把乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、三陰性型和HER-2過(guò)表達(dá)型4種亞型[1]。三陰性乳腺癌占所有乳腺癌病例的15%～20%[2]，因其侵襲性強(qiáng)、病情進(jìn)展快等特點(diǎn)，給臨床上患者治療帶來(lái)嚴(yán)重的困難。目前三陰性乳腺癌的臨床治療方法主要是化療[3]，但化療后復(fù)發(fā)率高，且3年內(nèi)生存率低。此外，三陰性乳腺癌由于易發(fā)生侵襲性肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移，死亡率更高[4-6]。目前治療三陰性乳腺癌的化療藥物效果有限，且靶向治療藥物欠缺，因此亟待研究出新的治療三陰性乳腺癌的藥物。隨著天然藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用，吲哚類藥物的研發(fā)日益引起人們的關(guān)注。2,3-吲哚醌又名吲哚-2,3-二酮，是抗癌藥物靛玉紅的衍生物，具有抗菌、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[7-9]，且分子結(jié)構(gòu)小、毒性低，具有開發(fā)為治療三陰性乳腺癌化療新藥的潛能。

細(xì)胞凋亡的失調(diào)是癌癥發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要的方面[10-11]。p53基因(p53)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白基因(Bax)調(diào)控的家族蛋白是重要的凋亡相關(guān)蛋白，也是治療癌癥的潛在靶點(diǎn)[12-13]。MDM2基因(MDM2)是一種致癌基因，還是腫瘤抑制因子p53最重要的負(fù)性調(diào)控因子，破壞p53與MDM2之間的相互作用，能使p53穩(wěn)定并激活[14]。因此，p53與MDM2之間互相調(diào)節(jié)，關(guān)系密切，可成為一個(gè)潛在的藥物作用靶點(diǎn)。本研究通過(guò)檢測(cè)BT549細(xì)胞中p53、Bcl-2、Bax以及MDM2 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，探討2,3-吲哚醌對(duì)三陰性乳腺癌BT549細(xì)胞的抑制作用及分子機(jī)制，以期為2,3-吲哚醌的藥物研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

乳腺癌BT549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)；2,3-吲哚醌購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶消化液購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒及引物購(gòu)自北京全式金生物有限公司；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體、P53、Bcl-2、Bax、MDM2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清以及0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌BT549細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)到60%左右的狀態(tài)時(shí)，加入梯度濃度2,3-吲哚醌后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至72 h。2,3-吲哚醌使用二甲亞砜溶解，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋為相應(yīng)濃度。

1.3 2,3-吲哚醌對(duì)乳腺癌BT549細(xì)胞的抑制作用和毒性

在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)BT549細(xì)胞，當(dāng)96孔板中細(xì)胞的生長(zhǎng)率達(dá)到60%左右時(shí)，分別加入0、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L 的2,3-吲哚醌(每個(gè)濃度值設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔)，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，并放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化2 h，后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。根據(jù)抑制率公式計(jì)算2,3-吲哚醌對(duì)BT549細(xì)胞的抑制率，并采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。

1.4 2,3-吲哚醌對(duì)乳腺癌BT549細(xì)胞侵襲、遷移的抑制作用

1.4.1劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板之中常規(guī)培養(yǎng)BT549細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)率達(dá)到60%左右時(shí)，分別加入不同濃度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用微移液管的尖端在每個(gè)孔中垂直和水平各畫2條線，并在不同的時(shí)間點(diǎn)(0、12、24 h)使用顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合的情況。

1.4.2Transwell實(shí)驗(yàn) 在24孔板當(dāng)中常規(guī)培養(yǎng)BT549細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)率達(dá)到60%左右時(shí)，加入不同濃度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)液放置培養(yǎng)箱中孵育1 h后，使基質(zhì)膠凝固。將上述加藥培養(yǎng)后的細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，于每孔上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直至觀察到下室有細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)終止培養(yǎng)。取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗2次，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)細(xì)胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

常規(guī)培養(yǎng)BT549細(xì)胞，生長(zhǎng)率達(dá)到60%左右時(shí)，分別加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用trizol試劑提取BT549細(xì)胞的總RNA。RNA濃度測(cè)定后，進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄和qPCR實(shí)驗(yàn)，模板cDNA使用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qPCR體系采用全式金試劑盒構(gòu)建。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中MDM2、Bcl-2、Bax、P53蛋白相對(duì)表達(dá)量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理72 h，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加內(nèi)參照一抗和目標(biāo)蛋白一抗(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。然后使用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗溶液孵育1 h，再次用1×TBST洗膜10 min，重復(fù)3次。最后將ECL發(fā)光液按說(shuō)明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH的條帶結(jié)果為內(nèi)參照，將目的蛋白的條帶與內(nèi)參照進(jìn)行比較，得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2,3-吲哚醌對(duì)BT549細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0～1 600 μmol/L組的細(xì)胞增殖率分別為1.00±0.00、0.98±0.04、0.92±0.02、0.81±0.04、0.62±0.04、0.43±0.02、0.21±0.06。與0 μmol/L組比較，2,3-吲哚醌的藥物濃度越高，BT549細(xì)胞的增殖率越低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.64，P<0.01)。使用SPSS Statistics軟件計(jì)算得出2,3-吲哚醌對(duì)BT549細(xì)胞的IC50為609 μmol/L，最終篩選出0、100、200、400 μmol/L的2,3-吲哚醌為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。

2.2 2,3-吲哚醌對(duì)BT549細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，0、100、200、400 μmol/L組細(xì)胞的侵襲率分別為92.00±1.15、58.00±1.15、22.33±1.45、16.33±1.33。與0 μmol/L組比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，BT549細(xì)胞的侵襲能力逐漸減弱(F=751.48，P<0.01)。見圖1。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0、100、200、400 μmol/L組細(xì)胞的遷移率分別為0.80±0.01、0.72±0.03、0.45±0.02、0.21±0.03。與0 μmol/L組相比較，2,3-吲哚醌的濃度越高，BT549細(xì)胞的遷移能力越低 (F=314.67，P<0.01)。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

qPCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的逐步升高，細(xì)胞中p53及BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增高(F=62.82、20.86，P<0.01)，Bcl-2、MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸下降(F=21.53、30.31，P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組細(xì)胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，隨著藥物濃度增高，細(xì)胞中P53、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)水平逐漸增高(F=29.59、53.12，P<0.01)，Bcl-2和MDM2蛋白相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低(F=14.85、159.81，P<0.01)。見表3、圖3。

A、B、C、D分別經(jīng)0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理

A、B、C、D分別經(jīng)0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理

表3 各組細(xì)胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%，在乳腺癌1型突變相關(guān)的患者中，80%以上發(fā)展為三陰性乳腺癌[15]。目前，三陰性乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)、化療和放療，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，化療敏感性較低，且易產(chǎn)生耐藥性，腫瘤復(fù)發(fā)率高[16]，嚴(yán)重地威脅著女性的健康，因此，開發(fā)靶向治療三陰性乳腺癌的新型藥物是科研人員的研究熱點(diǎn)，也是臨床上治療乳腺癌的迫切需要。

目前，三陰性乳腺癌的化療藥物主要是蒽環(huán)類、紫杉類和鉑類藥物，但是部分患者對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，且預(yù)后差，效果差強(qiáng)人意[17]。2,3-吲哚醌是一種內(nèi)源性生物因子，分布廣泛，具有多種生物活性和藥理活性[18]，其分子量小，化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，毒副作用小，具有開發(fā)為抗腫瘤藥物的潛能。研究表明，在抗癌藥物舒尼替尼和磷酸托塞拉尼布中，2,3-吲哚醌是其重要的藥效單位[19]。此外，2,3-吲哚醌還能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移[20]。2,3-吲哚醌的合成衍生物對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231具有抗增殖的作用[21]。可見，2,3-吲哚醌與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。p53是一種重要的抑癌基因，可參與腫瘤的多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[22]。p53是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，大約50%的惡性腫瘤與p53的功能喪失有關(guān)[23]。2,3-吲哚醌發(fā)揮抑制腫瘤作用的分子機(jī)制是否與p53有關(guān)，目前尚不清楚。因此本研究主要探討2,3-吲哚醌能否通過(guò)P53信號(hào)通路來(lái)抑制三陰性乳腺癌BT549細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究中使用不同濃度的2,3-吲哚醌處理人乳腺癌BT549細(xì)胞72 h后，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，隨著2,3-吲哚醌濃度增加，細(xì)胞增殖明顯被抑制。Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)表明，2,3-吲哚醌對(duì)乳腺癌BT549細(xì)胞有明顯的抑制侵襲以及遷移的作用。qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了加藥處理后，細(xì)胞中p53、Bax、Bcl-2和MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量和P53、Bax、Bcl-2和MDM2蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量以及P53、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，Bax和MDM2的mRNA相對(duì)表達(dá)量以及Bax、MDM2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，證明了2,3-吲哚醌很可能通過(guò)激活P53信號(hào)通路抑制乳腺癌BT549細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此研究為研發(fā)2,3-吲哚醌治療三陰性乳腺癌提供了基本的理論基礎(chǔ)，但只是在體外水平上驗(yàn)證了2,3-吲哚醌對(duì)乳腺癌BT549細(xì)胞的作用，后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述2,3-吲哚醌對(duì)三陰性乳腺癌BT549細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且其機(jī)制可能是通過(guò)激活P53信號(hào)通路抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，初步顯示了2,3-吲哚醌具有開發(fā)為治療三陰性乳腺癌化療新藥的潛能。