EXAKT硬組織切磨技術在含有植入物組織切片中的應用

(1 山東大學口腔醫(yī)學院山東省口腔組織再生重點實驗室，山東 濟南 250012； 2 山東大學齊魯醫(yī)院口腔科；3 山東大學齊魯醫(yī)院心血管重構與功能研究重點實驗室； 4 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科)

組織形態(tài)研究中常常涉及含有各類植入物的軟硬組織，例如含有鈦合金種植釘或者骨粉的頜骨、股骨組織，含有熒光素標記的骨組織，以及含有金屬支架的血管肌肉組織等，該類組織因其植入物的特殊性，無法按照常規(guī)的石蠟切片流程將其制成組織切片。常規(guī)的石蠟切片在處理該類組織時具有以下弊端：①無法切割金屬種植體；②采用脫鈣技術以降低組織的硬度[1-3]，脫鈣會引起骨組織皺縮，從而導致骨組織與植入物分離；③熒光標記的組織內熒光標記物與新骨鈣鹽螯合，脫鈣技術會導致熒光標記物流失[4-6]，嚴重影響結果分析[7]。因此普通的石蠟切片已經無法滿足實際需求。以EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)為代表的軟硬組織切磨技術則可以解決這一問題[8]。本研究擬將不能用常規(guī)方法制備的含有不同植入物的組織，應用EXAKT硬組織切磨技術進行制作后，觀察是否能夠保持組織本身及植入物與組織之間的原有組織形態(tài)，從而評價該技術對含有不同植入物組織類型的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1實驗材料 含有鈦合金螺紋種植釘的比格犬下頜骨組織(A組織)、含有鈦合金直釘的小鼠股骨組織(B組織)、含有鈦合金螺紋種植釘的小鼠股骨組織(C組織)、含有多孔鈦材料的兔股骨踝骨組織(D組織)、含有鈷鉻合金支架的兔心血管組織(E組織)、含有鈣黃綠素和茜素絡合復合物標記的大鼠上腭組織(F組織)。

1.1.2主要儀器 EXAKT 300CP/400CS/AW硬組織切磨系統(tǒng)購自德國EXAKT公司，該系統(tǒng)包括組織切片機、組織磨片機、載片真空吸附裝置、光固化包埋機、組織脫水浸潤儀、數顯千分尺等。

1.2 研究方法

1.2.1組織固定 將上述6種新鮮組織標本置于40 g/L的多聚甲醛固定液中，于低溫(4 ℃)下固定24～48 h，具體固定時間視組織切塊大小調節(jié)，固定結束后流水沖洗24 h。

1.2.2組織脫水、浸潤與包埋 將組織塊置于體積分數0.50、0.70、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液中并逐級上行脫水，每級脫水12 h；脫水結束后將組織逐級浸入體積分數0.50、0.30的無水乙醇光固化樹脂(Technovit 7200VCL)中，每級浸潤時間3～5 d，最后浸入純光固化樹脂Ⅰ以及Ⅱ中，每級浸潤時間5～7 d。將經過充分浸潤的組織置于尺寸合適的包埋模內，倒入光固化樹脂，將包埋模放在光固化包埋機內進行聚合。先使用低強度光源照射，使包埋劑聚合約4 h；再使用高強度的藍光照射使?jié)B透到組織內的包埋劑完全固化，聚合時間視組織塊的大小和厚度而定，約4～10 h。

1.2.3粘接載片 切割組織塊獲得目的切面，在下載片上滴粘合劑(Technovit 7210VLC)將組織塊的非切割面與下載片粘合，光固化10 min。將組織塊吸附在切片機夾具上，通過金剛鋸條切割獲得目的切面。將組織塊吸附于磨片機對目的切面進行打磨拋光。用真空精密吸附壓機將平行載片粘接到拋光后組織面上，粘合劑為Technovit 7210VLC，粘合劑要適量，不要產生氣泡，光固化10 min。

1.2.4制作實驗組織的切磨片 將組織塊粘合有實驗組織的下載片吸附于切片機的夾具上，調節(jié)夾具位置，從上載片一側切割得到厚約200 μm的切片。將切割得到的厚片吸附于磨片機上，用各級砂礫的砂紙對切片進行打磨，得到預期厚度，最后用細砂紙對切片進行拋光。

1.2.5實驗組織切片染色 A和B組織切片先進行Ladewig染色，鐵蘇木素AB液1∶1混合后，染色5 min(現用現配)，流水沖洗5 min, Ladewig混合液染色5 min，流水沖洗至合適的顏色，自然干燥后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。C、D、E組織切片進行蘇木精-伊紅染色，滴加蘇木精于切片表面，染色5 min，流水沖洗多余染液后將切片置于體積分數0.01鹽酸乙醇中分化30 s，流水沖洗后浸入伊紅復染3 min，再流水沖洗多余染料后自然干燥，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.6F組織行熒光素標記并熒光顯微鏡觀察 將F組織切片置于載物臺，分別選擇藍光和綠光激發(fā)，觀察鈣黃綠素和茜素絡合物發(fā)光效果并拍照，利用組合通道將圖片進行疊加。

2 結 果

2.1 A、B組織切片Ladewig染色結果

A、B組織Ladewig染色后邊緣軟組織呈黃色，骨組織呈藍色。A組織切片在光學顯微鏡下觀察顯示種植體(黑色)與骨組織(藍色)結合緊密，螺紋附近均為新生骨(紅色箭頭處)，染色較均勻(圖1a)。B組織切片在光學顯微鏡下觀察顯示種植體(黑色)與骨組織(藍色)結合緊密，邊緣軟組織保留完整，切片無雜質無劃痕(圖1b、c)。

2.2 C、D、E組織切片蘇木精-伊紅染色結果

C、D、E組織切片蘇木精-伊紅染色后，細胞核呈藍色，胞漿呈紅色，新生骨組織一般呈淺紅色。C組織切片在光學顯微鏡下觀察示種植釘螺紋(黑色)附近有大量新生骨(綠色箭頭處)，新生骨小梁(黃色箭頭處)靠近種植釘生長，舊骨髓腔內疏松軟組織(淺黃色)清晰可見，整體染色均勻(圖1d、e)。D組織切片在光學顯微鏡下觀察顯示鈦材料(黑色)與原舊骨(深紅色)結合緊密，而且周圍明顯附著大量的新生骨(綠色箭頭處)，種植體無移動脫落現象，原舊骨無缺損，腔內疏松軟組織(淺黃色)清晰完整(圖1f、g)。E組織切片在光學顯微鏡下觀察顯示，支架材料(黑色)保持在原位，無脫落現象，血管壁(淺紅色)分層明顯無缺損(圖1h、i)。

2.3 F組織的熒光顯微鏡觀察結果

熒光顯微鏡下F組織切片的鈣黃綠素(綠色)和茜素絡合物(紅色)所發(fā)出的熒光清晰可見(圖1j、k)，通道疊加圖可清晰看到熒光分布和走向(圖1l)。

3 討 論

硬組織切片技術是近年來快速發(fā)展起來的一種新興技術，無需脫鈣處理，組織經固定、脫水、包埋、切片、磨片與染色后制成切片，既縮短了制片周期，又保護了組織的完整性，因高效快捷而迅速被推廣應用[9-14]。因為EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)的切割帶含有等粒徑金剛石顆粒，磨片用的砂紙含有碳化硅顆粒，硬度較高，可以用來切割鈦合金或鈷鉻合金等硬度較高的種植體，制成的切片厚度均一，組織結構形態(tài)保持完好，染色后可以通過光學顯微鏡下觀察，也可以通過電鏡下觀察；還可用于切割纖維樁等材料，而且切出的材料厚度均勻一致，表面光滑，無需打磨，所以該技術在組織切片制作中成為更多科研工作者的首選[15-16]。硬組織切片染色方法較多，常用的有甲苯胺藍染色、蘇木精-伊紅染色、Ladewig染色、Van-Gieson染色、Giemsa染色等[17-19]，通過對顏色、位置、骨界面定量分析，可以觀察牙結石、齲病的發(fā)生、種植體與骨組織的結合、新骨生成、血管炎癥反應、種植體表面成骨的細微變化等情況。

a:A組織切片Ladewig染色結果(100倍)；b、c：B組織切片Ladewig染色結果(4、100倍)；d、e：C組織切片蘇木精-伊紅染色結果(4、100倍)；f、g:D組織切片蘇木精-伊紅染色結果(4、100倍)；h、i：E組織切片蘇木精-伊紅染色結果(4、100倍)；j、k、l：F組織切片熒光顯微鏡下觀察結果(100倍)

圖1 組織切片鏡下觀察結果

本研究選取了具有代表性的6種組織類型，含有鈦合金種植釘的比格犬頜骨組織在口腔醫(yī)學研究中是最為常見的組織，該類組織的骨成分復雜，種植釘較大；含有鈦合金直釘和螺紋種植釘的小鼠股骨相對來講骨組織較為單一，種植釘較??；含有多孔鈦材料的兔股骨踝骨是植入金屬球的組織代表[20-21]，該類組織制作切片時植入物與骨組織結合不牢固易脫出；含有鈷鉻支架的兔心血管組織是植入細小金屬支架的代表，該類組織是心腦血管研究中較為常見的組織類型；含有鈣黃綠素和茜素絡合物標記的大鼠上腭組織是熒光素標記的組織代表，組織中的熒光素在普通切片制作中易丟失[22]。

本研究的組織切片主要進行了兩組染色，Ladewig染色對軟組織的著色更加明顯，軟組織呈黃色，骨組織呈藍色，并且可以清晰地顯示骨的疏密程度；蘇木精-伊紅染色是組織切片的常規(guī)染色方法，可以觀察骨組織基本結構[23-26]。A和B組織切片經染色后可見邊緣完整的黃色軟組織，藍色骨組織與種植釘結合緊密，螺紋邊緣也出現新生骨。C組織切片經染色后可觀察到螺紋邊緣有大量新生骨，髓腔內的疏松軟組織完整；D組織切片經染色后可見鈦材料周圍有大量新生骨，顏色相對原生骨較淺，腔內軟組織未脫落；E組織經染色后可見支架，未發(fā)生位移和脫落，血管壁分層明顯。因此，對于外圍附著有軟組織及組分相對復雜的骨組織(如頜骨組織)可以選用Ladewig染色，組分相對單一的股骨、脛骨及血管等組織可以選用蘇木精-伊紅染色。

硬組織切片技術工藝復雜，制片流程環(huán)環(huán)相扣，稍有失誤則會影響后續(xù)制片，因此該技術在操作的過程中要注意以下問題：①組織固定浸潤操作過程中應注意時間的把握。組織固定結束后流水充分沖洗[27-28]，將固定液洗凈，若有殘留固定液則會影響后期染色的效果，含有熒光素標記的組織用體積分數0.75的乙醇溶液固定，甲醛或多聚甲醛溶液會對熒光素產生破壞，從而影響結果分析；脫水浸潤時間要充足，若浸潤不完全，包埋過后組織內部會出現大量空洞，或者出現組織外周硬中間軟的現象，制片過程中極易脫片，嚴重影響切片質量。②組織包埋過程中注意避免出現氣泡。包埋前輕輕震蕩模具，將光固化樹脂內部的氣泡振出，或將模具放入骨組織切片修復機內抽真空1 h，將氣體抽出，若殘存大量氣泡，包埋結束后組織周邊會出現空洞，影響切片質量。③組織切磨片過程中避免出現氣泡和劃痕。粘接載片時注意動作要慢要輕，避免產生氣泡，粘合劑7210應適量，過多會從上載片溢出，損壞載片真空吸附裝置，過少會導致粘合不完全，邊緣翹起易脫片；磨片時按照砂礫由大到小逐級打磨，若打磨不充分，會產生大量黑色劃痕，影響觀察效果；打磨帶有金屬支架的血管組織時要低速慢磨，否則金屬材料極易從血管內壁脫落[29-30]。④組織切片染色前應注意載片清潔使染色更加美觀。含有熒光素的切片應先在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況并保存數據后再進行染色，如果先行染色，染料會遮蓋熒光信號，鏡下觀察時模糊不清，嚴重影響熒光結果分析；切片染色前用軟毛刷清潔載片表面，清除磨片過程中粘附在載片上的雜質顆粒，使染色清晰美觀，染色時盡量避免滴染，否則易造成著色不均勻，影響染色效果[31]。⑤封片時應注意中性樹膠的用量，封好的切片應注意保存。封片時中性樹膠不可滴加過多，否則切片不易干，蓋玻片與組織之間易滑動，影響觀察，封好的切片應放置在陰涼通風處，避免陽光直射，避免放在空調房等比較干燥的環(huán)境。

綜上所述，EXAKT硬組織切磨技術可將含有金屬植入物、骨粉、熒光標記的各種軟硬組織制成高質量的薄切片，切片厚度均勻，劃痕極少，穩(wěn)定性高，在顯微鏡下可清晰地觀察到軟硬組織形態(tài)及熒光標記，經各種染色后可進行骨界面、骨愈合的定量分析，在骨科等組織形態(tài)研究領域有廣泛的應用前景。