白念珠菌CaPDE2基因的敲除與功能研究

毛紅辰，張 幸，許海濤，李 峰，徐大勇，2①

（1. 淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北235000；2. 淮北師范大學 信息學院，安徽 淮北235000）

0 引言

白念珠菌（Candida albicans）是臨床上最常見的人體條件致病真菌，存在于健康人體的口腔、上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜表面. 白念珠菌通常不會引起人體疾病，但是當人體免疫系統(tǒng)受到損害或體內(nèi)正常微生物菌群失調(diào)時，該菌過度生長引起淺部感染（如鵝口瘡、陰道炎等）；在免疫能力嚴重低下的人群中（如艾滋病患者、器官移植病人、經(jīng)過化療和理療的癌癥病人等），白念珠菌過度繁殖引起嚴重的系統(tǒng)性感染［1-2]. 據(jù)報道，在世界范圍內(nèi)，白念珠菌感染每年造成25萬到40萬患者死亡，以及大約1億次的復發(fā)性陰道炎的發(fā)病率［3-4]. 由于病人治療過程中大量使用抗真菌藥物，以及白念珠菌在病人人體組織和植入人體的導管等醫(yī)療器具表面形成生物膜，導致白念珠菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴重［5-8]. 因此，研究揭示白念珠菌的致病、耐藥機制，發(fā)現(xiàn)新型抗真菌藥物的基因靶點，對預防和治療白念珠菌感染具有重要意義.

白念珠菌SC5314基因組測序的完成［9]，為其基因功能的研究提供了極大的便利. 通過基因敲除并測試基因缺失株的表型是研究基因功能最常用的方法之一，由于白念珠菌一般情況下是二倍體細胞，基因敲除有一定的難度. 目前白念珠菌的基因敲除技術一般是基于營養(yǎng)缺陷型或抗藥性標記. 例如：URA3-blaster（尿苷合成基因標記）［10]、SAT1-flipper（諾爾斯菌素抗性基因標記）［11]、從非白念珠菌PCR 擴增HIS1/LEU2/ARG4營養(yǎng)標記敲除盒等［12]. 但是單一使用一種基因標記敲除方法存在敲除效率低的問題.真核生物細胞中，cAMP信號通路調(diào)控多種細胞過程，其過程是胞外信號與細胞表面相應受體結合，從而導致細胞內(nèi)第二信使cAMP 的水平變化而引起細胞各種反應［13]. 環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（Cyclic nucleo?tide phosphodiesterase，PDE）是催化細胞內(nèi)環(huán)核苷酸水解的一類磷酸酯酶，對細胞內(nèi)cAMP/AMP 或者cGMP/GMP水平進行控制，從而調(diào)控的細胞生理代謝反應［14]. 在釀酒酵母中，ScPDE2編碼對cAMP具有高親和力的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶2（ScPde2），其在控制細胞內(nèi)cAMP/AMP濃度及調(diào)節(jié)多個生理過程起到重要作用［15]. 本研究以人體條件致病真菌白念珠菌CaPDE2為例，綜合應用尿苷合成基因標記（URA3）和諾爾斯菌素抗性基因標記（SAT1）高效敲除CaPDE2基因，并測試CaPDE2基因缺失株的表型，對CaPDE2基因在白念珠菌細胞中的功能進行探究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物：本研究使用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2.

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒

表2 本研究使用的引物

1.1.2 主要藥品及試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、氨芐青霉素鈉等購自寶生物工程有限公司；Ezmax One-Step 克隆試劑盒購自吐露港生物科技有限公司；諾爾斯菌素（ClonNAT）購自Jena Bioscience 公司；所有引物及5-氟乳清酸（5-FOA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鮭魚精DNA、醋酸鋰、聚乙二醇3350、酮康唑、氟康唑等購自Sigma公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB+Amp培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 7.0，滅菌后加氨芐青霉素鈉濃度至100 μg/mL；YPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；YPD+200 μg/mL ClonNAT培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為200 μg/mL 的ClonNAT；YPD+25 μg/mL ClonNAT 培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為25 μg/mL的ClonNAT；YPD+0.1% 5-FOA培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為0.1%的5-氟乳清酸（5-FOA）. SD-URA 培養(yǎng)基：無氨基酸酵母氮源6.7 g/L，省卻尿苷酸氨基酸混合物粉末0.71 g/L，葡萄糖20；SD-URA+200 μg/mL ClonNAT 培養(yǎng)基：SD-URA培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為200 μg/mL的ClonNAT.

1.2 方法

1.2.1 CaPDE2基因的SAT1-flipper敲除盒的構建

以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以白念珠菌SC5314基因組作為模板，通過PCR方法擴增敲除CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒.

1.2.2 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構建

用引物PDE2-L-UP、PDE2-L-DOWN，以白念珠菌SC5314 基因組作為模板，通過PCR 擴增出CaP?DE2 開放閱讀框上游序列965 bp 作為基因敲除上游同源臂，通過無縫克隆試劑盒克隆到質(zhì)粒p5921 的SacI和KpnI位點；然后，用引物PDE2-R-UP、PDE2-R-DOWN，以白念珠菌SC5314基因組作為模板，通過PCR擴增出CaPDE2開放閱讀框下游序列713 bp作為基因敲除下游同源臂，克隆到質(zhì)粒p5921的BamHI和HindⅢ位點；至此獲得CaPDE2基因的URA3-blaster 敲除質(zhì)粒，然后用SacI和HindⅢ雙酶切此敲除質(zhì)粒，即獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒.

1.2.3 CaPDE2雙等位基因的敲除

用方法1.2.1 獲得的CaPDE2 基因的SAT1-flipper 敲除盒，采用醋酸鋰方法［11]轉(zhuǎn)化到野生型菌株CAI4，在YPD+200 μg/mL ClonNAT平板上篩選獲得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株；用方法1.2.2獲得的CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒，采用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化到敲除CaPDE2第一等位基因的菌株中，在SD-URA+200 μg/mL ClonNAT 平板上篩選獲得敲除CaPDE2第二等位基因的菌株. 將敲除CaPDE2雙等位基因的菌株依次培養(yǎng)在YPD+25 μg/mL ClonNAT、YPD+0.1% 5-FOA平板上，以去除諾爾斯菌素抗性基因標記SAT1和尿苷合成基因標記URA3.

1.2.4 CaPDE2缺失株的表型試驗

挑取CAI4、CaPDE2缺失株菌株的單菌落接種到YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，之后將CAI4、CaPDE2缺失株菌株的細胞培養(yǎng)液調(diào)成5×107個細胞/mL. 按照文獻［16-17]表型試驗操作方法將菌液被稀釋至10-4. 然后從每個離心管中吸取2 μL稀釋菌液點接至YPD及含有相應藥物的YPD培養(yǎng)基上. 30 ℃倒置培養(yǎng)，拍照觀察.

2 結果與分析

2.1 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構建

以野生型菌株CAI4 基因組DNA 為模板，PDE2-L-UP、PDE2-L-DOWN為引物進行PCR 反應，擴增出CaPDE2 開放閱讀框上游的同源片段965 bp，擴增產(chǎn)物純化后連接到用SacI、KpnI處理的p5921 載體中，獲得質(zhì)粒pDY1. 接下來，以白念珠菌SC5314 基因組DNA 為模板，PDE2-R-UP、PDE2-R-DOWN 為引物進行PCR反應，擴增出CaPDE2 開放閱讀框下游的同源片段713 bp，擴增產(chǎn)物純化后連接到用Bam?HI、HindⅢ處理的pXD1載體中，獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2，如圖1所示. 將pDY2用SacI、HindⅢ雙酶切，獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒（5.7 kb），如圖2所示.

圖1 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構建示意圖

圖2 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2的SacI、HindⅢ雙酶切驗證

2.2 聯(lián)合應用尿苷合成基因標記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因

白念珠菌是二倍體，對白念珠菌基因的敲除必須敲除目的基因的兩個等位基因. 本研究出發(fā)菌株CAI4是尿苷營養(yǎng)缺陷型菌株［10]，而且對諾爾斯菌素敏感［11]. 白念珠菌CaPDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA 通路中的重要成員，該酶催化cAMP 水解成5′-AMP 而降低胞內(nèi)cAMP 濃度，以維持胞內(nèi)適當?shù)腸AMP濃度. 應用諾爾斯菌素抗性基因標記SAT1敲除CaPDE2第一等位基因. 以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4 基因組作為模板，PCR 擴增出大小約為4.3 kb 的CaPDE2 的SAT1-flipper 敲除盒（圖3）. 將該敲除盒轉(zhuǎn)化至CAI4 中，涂布于200 μg×mL-1ClonNAT 的YPD 平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取ClonNAT 抗性菌株純化，獲得敲除CaPDE2 第一等位基因的菌株，其基因型是Cap?de2：：SAT1-flipper/CaPDE2. 接下來，將構建好的含有CaPDE2 的URA3-blaster 敲除盒的質(zhì)粒pDY2，用SacI和HindⅢ雙酶切，獲得5.7 kb帶有URA3篩選標記的CaPDE2敲除盒（圖2）. 將此敲除盒轉(zhuǎn)化至菌株Capde2：：SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200 μg/mL ClonNAT平板上，30 ℃培養(yǎng)48～72 h，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并驗證，獲得敲除CaPDE2第二等位基因菌株. 之后用YPD+25 μg/mL ClonNAT平板擠掉SAT1 抗性基因，進一步用YPD+0.1% 5-FOA 平板去除URA3 基因，最終獲得CaPDE2 基因缺失株DY?CA1，其基因型為Capde2：：FRT/Capde2：：hisG（圖4，5）. 如圖5 所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOWCHECK：以CAI4基因組為模板，擴增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全長ORF序列及其一部分啟動子和終止子序列）；以CaPDE2 基因缺失株的基因組為模板，擴增出0.85 kb 和1.7 kb（包含hisG 序列及CaPDE2基因的一部分啟動子和終止子序列）的2個片段. 用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因組為模板，擴增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因組為模板，未擴增出目標條帶，表明CaPDE2的2個等位基因都已被敲除.

圖3 PCR擴增CaPDE2的諾爾斯菌素抗性SAT1-flipper敲除盒

圖4 聯(lián)合應用尿苷合成基因標記URA3和諾爾斯菌素 抗性基因標記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖

2.3 CaPDE2基因缺失株對氟康唑、酮康唑、SDS及42 ℃的敏感

圖5 CaPDE2基因缺失株的PCR驗證

圖6 白念珠菌CaPDE2基因缺失株對氟康唑、酮康唑、SDS及42 ℃的敏感性

通過倍比稀釋表型試驗發(fā)現(xiàn)（圖6），與野生型菌株CAI4 相比，CaPDE2 基因缺失株對4 μg/mL KCZ（Ketoconazole，酮康唑）、5 μg/mL FLU（Fluconazole，酮康唑）、細胞膜干擾劑0.04% SDS（Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）以及42 ℃均敏感，表明白念珠菌CaPDE2基因在耐受抗真菌藥物、細胞膜壓力及高溫脅迫方面起作用.

3 結論與討論

在本研究中，聯(lián)合采用URA3 和SAT1 篩選標記完成了CaPDE2 雙等位基因的敲除，并獲得了去掉SAT1和URA3基因標記的CaPDE2基因缺失株，其基因型為Capde2：：FRT/Capde2：：hisG. 白念珠菌基因敲除的難度在于目的基因第二等位基因的敲除，本研究聯(lián)合應用URA3和SAT1篩選標記進行基因敲除的優(yōu)勢：一是可以高效敲除目的基因的第二等位基因；二是去掉SAT1和URA3基因標記的缺失株可以用于構建多個基因的缺失株，研究多個基因（2個以上基因）的缺失對于白念珠菌的影響或用于研究多個基因之間的相互關系.

表型試驗結果表明，CaPDE2基因缺失株對細胞膜干擾劑SDS敏感，與Jung等［18]報道的結果一致，表明敲除CaPDE2 基因很可能導致白念珠菌的細胞膜組分發(fā)生變化，從而導致CaPDE2 基因缺失株對SDS敏感. 研究還發(fā)現(xiàn)，CaPDE2基因缺失株對抗真菌藥物氟康唑和酮康唑敏感，表明CaPDE2基因在耐受唑類抗真菌藥物起作用. 唑類藥物是目前臨床常用的抗真菌藥物，唑類藥物發(fā)揮抗真菌作用是通過干擾羊毛甾醇14-α-去甲基化酶活性使得麥角甾醇的合成受阻，導致有毒的甾醇14-α-methyl-3，6-diol 的積累，該有毒甾醇的積累會使真菌細胞膜形成嚴重的壓力，從而起到抗真菌作用［19]. 但是由于目前唑類抗真菌藥物的大量使用，使得白念珠菌對唑類藥物產(chǎn)生了嚴重的抗藥性［20]. 白念珠菌缺失CaPDE2基因?qū)е录毎麑蝾愃幬锩舾?，因此，CaPDE2可以作為開發(fā)新的抗真菌藥物的潛在靶點. 本研究還表明，CaP?DE2基因缺失株對42 ℃敏感，其具體耐熱機制有待進一步研究.