精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白研究進(jìn)展

鐘亞楠，牛長敏，夏蒙蒙，鄭英

綜 述

精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白研究進(jìn)展

鐘亞楠，牛長敏，夏蒙蒙，鄭英

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，揚(yáng)州 225001

精子尾部結(jié)構(gòu)與其運(yùn)動功能密切相關(guān)。精子的運(yùn)動能力直接決定了精子能否正常運(yùn)輸?shù)捷斅压芘c卵子受精。精子尾部的形成和發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，由多種蛋白質(zhì)精細(xì)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，多種精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白的缺陷可導(dǎo)致少、弱、畸形精子癥。本文根據(jù)精子尾部的超微結(jié)構(gòu)順序，對近年來精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為男性不育癥的遺傳學(xué)診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐的可能。

精子尾部；發(fā)育；蛋白；研究進(jìn)展

精子尾部結(jié)構(gòu)與精子運(yùn)動功能密切相關(guān)，具有正常尾部結(jié)構(gòu)的精子才能游動。精子尾部分為頸段、中段、主段和末段4個部分(圖1)，其中頸段由前端的小頭、中間的中心粒、后端的節(jié)柱組成。在精子頭部細(xì)胞核末端形成了植入窩，基底板緊貼核膜，小頭連著基底板，節(jié)柱向軸絲延伸。人精子頸段含有近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒2個中心粒，前者與小頭相鄰，后者嵌入在節(jié)柱中。中段的中軸為軸絲，外面依次包繞著外周致密纖維和線粒體鞘；主段外側(cè)沒有線粒體鞘，代之以纖維鞘；末段僅有軸絲，其外側(cè)包裹著細(xì)胞膜(圖1)。軸絲貫穿精子尾部全長，其由“9+2”微管結(jié)構(gòu)組成，即中心為2條中央微管，外側(cè)環(huán)繞著9條外周雙聯(lián)微管。外周雙聯(lián)微管由A、B兩個亞單位構(gòu)成，A亞單位上附有外動力蛋白臂(outer dynein arm, ODA)和內(nèi)動力蛋白臂(inner dynein arm, IDA)，并發(fā)出放射輻(radial spokes, RS)向中央微管呈放射狀分布，將中央微管與外周微管連接起來。在精子尾部中段和主段的軸絲外側(cè)有9根外周致密纖維(outer dense fiber, ODF)，它是精子尾部的骨架，與精子尾部彈性回縮有關(guān)。精子的線粒體鞘(mitochondrial sheath, MS)是由線粒體呈螺旋狀纏繞而成，為精子運(yùn)動提供能量。精子尾部主段ODF外側(cè)的纖維鞘(fibrous sheath, FS)是由背側(cè)縱柱、腹側(cè)縱柱和環(huán)形肋組成，F(xiàn)S是調(diào)整精子尾部擺動的平面，為調(diào)節(jié)鞭毛彎曲和確定鞭毛擺動的形狀提供機(jī)械支撐，并作為參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)和產(chǎn)生精子運(yùn)動所需能量的糖酵解酶的支架[1]。在精子尾部中段和主段連接處有一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)稱為annulus，由絲狀物構(gòu)成，它與質(zhì)膜緊密相連，也稱為Jensen’s環(huán)。在軸絲開始從精子細(xì)胞延伸時，annulus就已經(jīng)形成，它最初位于鞭毛基部，在精子的伸長和分化過程中沿著軸絲向中段和主段交界處遷移。Annulus的完整性是精子運(yùn)動和精子尾部分化所必需的，annulus形成了一個蛋白質(zhì)擴(kuò)散屏障以建立合適的細(xì)胞區(qū)間，從而對中段–主段連接處進(jìn)行調(diào)節(jié)，防止線粒體末端螺旋發(fā)生移位，確保中段正確組裝[2]。Annulus的缺失主要造成精子尾部嚴(yán)重彎曲[3]。沒有annulus的精子常出現(xiàn)線粒體缺陷，包括線粒體排列異常、大小不等、外觀不規(guī)則和線粒體膜質(zhì)減少等[4]。研究表明：精子尾部每一個部分的發(fā)育均受到相關(guān)基因的精確調(diào)控，如果發(fā)生基因缺失或突變會導(dǎo)致其相應(yīng)的編碼蛋白的改變，從而導(dǎo)致精子尾部結(jié)構(gòu)異?；虍a(chǎn)生功能障礙。本文按照精子尾部的超微結(jié)構(gòu)順序，對近年來精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白(表1)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為男性不育癥的遺傳學(xué)診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐的可能。

圖1 精子結(jié)構(gòu)模式圖

上方分別是精子尾部中段、主段和末段的橫斷面示意圖。

1 植入窩和基底板發(fā)育相關(guān)蛋白

哺乳動物中至少有5種SUN (Sad1 and UNC84 domain containing)蛋白，其中3種在小鼠中分別被命名為Sun1、Sun2和Sun3，另外2種SUN蛋白被命名為大鼠SPAG4 (sperm-associated antigen 4)和SPAG4L (sperm-associated antigen 4-like)，又分別稱為Sun4和Sun5。SUN5是SUN家族的新成員，位于精子頸段[5]，負(fù)責(zé)將頭尾連接體(head-tail coupling apparatus, HTCA)附著到精子的核膜上，這對精子頭尾部的連接至關(guān)重要?；蚯贸坌孕∈缶宇^尾交界處的植入窩和基底板關(guān)鍵成分出現(xiàn)缺失，HTCA雖然可以在精子形成早期成功組裝，但不能附著于核膜，隨著精子細(xì)胞的伸長，HTCA連同基底板一起從植入窩分離[6]?；蚯贸∈缶映尸F(xiàn)出球形頭部精子表型，但實(shí)際上是無頭精子，所謂的“球形頭部”內(nèi)不含染色質(zhì)，而是充滿了未清除的細(xì)胞質(zhì)和排列雜亂的線粒體，因此又將這種精子表型命名為假球形精子癥。

表1 精子尾部發(fā)育相關(guān)蛋白

OAZs (ornithine decarboxylase antizymes)由編碼，它屬于一個保守的基因家族，在脊椎動物中至少有及三個成員，其中只有在單倍體生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)。OAZ3是一個影響植入窩和基底板的蛋白，它以反饋的方式控制著細(xì)胞內(nèi)多胺的濃度，而多胺會影響精子頭尾連接處的構(gòu)建。基因突變小鼠精子頭尾容易發(fā)生分離，可觀察到無植入窩和基底板的脫落頭部和尾部，雖然脫落的頭部和尾部具有活動能力，但大多無頭的尾部會筆直地向前運(yùn)動[7]。總之，在精子發(fā)生過程中，OAZ3通過調(diào)控多胺的局部濃度而在頭尾連接的形成中發(fā)揮作用。

2 小頭和節(jié)柱發(fā)育相關(guān)蛋白

頸段負(fù)責(zé)將精子的頭部和尾部相連，不僅起著物理連接作用，還能啟動和調(diào)節(jié)成熟精子的尾部波形和整體運(yùn)動。小頭和節(jié)柱是精子頸段的主要結(jié)構(gòu)，在精子形成后期，對精子頭部與鞭毛的連接至關(guān)重要。

(spermatogenesis associated 6)是高度保守的精子發(fā)生基因之一，編碼一種小頭和節(jié)柱形成必需的蛋白，僅表達(dá)于精子頸段[8]。SPATA6對精子頸段的形成起著至關(guān)重要的作用。敲除會造成節(jié)柱形成畸形或缺失，頸段形成被完全破壞，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)無頭精子。但無頭的鞭毛仍具有運(yùn)動性，其波形來自主段–末段連接處，而不是精子頸段，表明在主段–末段連接處存在第二波形源，其獨(dú)立于頸段產(chǎn)生的第一波形源[8]。

3 中心體發(fā)育相關(guān)蛋白

(spermatogenesis and centriole associated 1 like)是一種新的生殖細(xì)胞特異性基因，位于小鼠10號染色體，大約包含一個8 kb區(qū)域，它以(spermatogenesis and centriole associated 1)基因命名。基因編碼精子中心體蛋白，與編碼氨基酸具有50%左右同源性。編碼蛋白含342個氨基酸，分子量大小為38 kDa[9]，位于精子頸段。敲除小鼠精子頭部、尾部在植入窩內(nèi)的基底板與小頭之間發(fā)生分離，繼而產(chǎn)生無頭和無尾的精子[10]。人類同源基因位于小鼠和人類之間保守的同源基因組區(qū)域(染色體21q22.3)。在精子形成過程中，可能通過與RIa亞基結(jié)合而增加PKA活性，而SPATC1L-PKA復(fù)合物能維持精子頭尾連接的穩(wěn)定性[10]。SPATC1L在植入窩中維持PKA活性可能對穩(wěn)定該區(qū)域至關(guān)重要。

(the gene encoding the 135 kDa centro-somal protein)也編碼一種中心體蛋白，對中心粒的發(fā)生，特別是中央微管的組裝至關(guān)重要，而中心粒對中心體的形成、軸絲和微管的生長至關(guān)重要?；蛲蛔儗?dǎo)致常染色體原發(fā)性小頭畸形[11]，突變的CEP135蛋白在中心粒附近形成聚集體[12]。CEP135表達(dá)水平的改變可能導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)紊亂，引起精子鞭毛多發(fā)性形態(tài)異常(multiple mor-phological abnormalities of the flagella, MMAF)。

此外，(cilia and flagella-associated pro-tein43)和(cilia and flagella-asso-ciated protein44)也可能參與了中心體的形成。和均在睪丸中特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)，又稱，位于10號染色體上，含有38個外顯子，編碼蛋白含1665個氨基酸。CFAP43是一種纖毛或鞭毛相關(guān)蛋白，在精子發(fā)生中起重要作用[13]。又稱，位于3號染色體上，含有35個外顯子，其編碼含1854個氨基酸。CFAP44全稱纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白44，含有1個WD40功能結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞骨架的組裝，可能在中心體形成過程中發(fā)揮作用[13]。和缺失均呈現(xiàn)出MMAF表型，且精子活力降低。

4 Manchette發(fā)育相關(guān)蛋白

Manchette由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成，是引導(dǎo)精子尾部延伸的短暫結(jié)構(gòu)，其從中心體開始形成，朝著核的方向建立正端，朝著尾部方向建立負(fù)端[14]，α-微管蛋白位于Manchette的負(fù)端。STK33和SEPT12能直接與Manchette作用，其中STK33通過與α-微管蛋白相互作用來影響Manchette發(fā)育，而SEPT12能同時與α-微管蛋白及β-微管蛋白相互作用。

(serine/threonine kinase)是一種廣泛表達(dá)的基因，位于人染色體11p15.3上，編碼一種人鼠同源且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在睪丸組織中表達(dá)量最高。表達(dá)于減數(shù)分裂I初級精母細(xì)胞及其后的生精細(xì)胞中。Stk33通過直接與α-微管蛋白相互作用來調(diào)節(jié)Manchette微管的組織結(jié)構(gòu)和功能[15]，缺失可導(dǎo)致Manchette形態(tài)異常，進(jìn)而引起精子頭部和尾部畸形，因而，對Manchette的形成必不可少。、和基因敲除小鼠與基因敲除小鼠具有最為相似的表型。

精子尾部軸絲的發(fā)育由鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(intrafla-gellar transport, IFT)介導(dǎo)。IFT由驅(qū)動蛋白II和動力蛋白1B共同負(fù)責(zé)，驅(qū)動蛋白II負(fù)責(zé)順向轉(zhuǎn)運(yùn)，動力蛋白1B負(fù)責(zé)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。其中，驅(qū)動蛋白II是一種異源三聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，包含KIF3A和KIF3B兩個運(yùn)動亞基及一個非運(yùn)動亞基KAP3。KIF3A位于長形精子細(xì)胞Manchette和成熟精子基底體及尾部主段，它在軸絲延伸和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞極性和基底體定位中起著重要作用。KIF3A是精子發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，對精子尾部形成和Manchette功能至關(guān)重要[17]。缺失可導(dǎo)致Manchette缺陷，軸絲發(fā)育不全，進(jìn)而影響精子頭部成形和尾部形成。

LRGUK1 (leucine-rich repeats and guanylate kinase-domain containing isoform 1)由LRR (leucine- rich repeat)、GUK-like (guanylate kinase-like)和UN (unnamed) 3個結(jié)構(gòu)域組成。LRGUK1通過LRR結(jié)構(gòu)域與KLC3結(jié)合，并通過GUK-like結(jié)構(gòu)域與HOOK2和RIMBP3結(jié)合[18]。實(shí)際上，LRGUK1與貨物連接蛋白HOOK1、HOOK2、HOOK3及貨物蛋白RIMBP3形成了一個多蛋白復(fù)合物，通過順向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KLC3的作用，沿著Manchette轉(zhuǎn)運(yùn)到HTCA，這對Manchette功能以及精子尾部從基底體延伸必不可少。LRGUK1作為多蛋白復(fù)合物關(guān)鍵組分，在單倍體雄性生殖細(xì)胞微管動力中發(fā)揮重要作用，LRGUK1的缺失破壞了這種復(fù)合物，造成精子頭部形態(tài)異常、頂體脫離細(xì)胞核和基底體無軸絲延伸。

基因?qū)儆诟叨缺Ｊ氐木哂蠫TP酶活性的蛋白家族。SEPTIN通過與各種細(xì)胞骨架蛋白相互作用來執(zhí)行細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞極性、有絲分裂、囊泡運(yùn)輸和擴(kuò)散屏障等功能[19]。SEPTIN家族的蛋白質(zhì)已被證明定位于annulus上，是其組成成分。哺乳動物annulus是由SEPTIN 1、4、6、7和12組成的多蛋白復(fù)合體，精子尾部的形態(tài)分化和擴(kuò)散屏障功能需要穩(wěn)定的SEPTIN復(fù)合物[2]。在減數(shù)分裂后雄性精子細(xì)胞中表達(dá)，在精子形成過程中，SEPT12與α-微管蛋白和β-微管蛋白相互作用，形成SEPT12-α-微管蛋白和SEPT12-β-微管蛋白復(fù)合物，這兩種復(fù)合物對精子頭部成形和尾部延伸起著重要作用[19]。SEPT12缺失會破壞α-微管蛋白和β-微管蛋白的組織和動力，影響α-微管蛋白和β-微管蛋白聚合，從而擾亂精子頭部成形和尾部延伸。突變后精子出現(xiàn)頭部畸形、尾部彎曲及annulus環(huán)缺陷。

除了與α-微管蛋白、β-微管蛋白相互作用之外，還有一些基因與Manchette相關(guān)，如MEIG1 (meiosis expressed gene 1)是一種最初被認(rèn)為在減數(shù)分裂中起作用的蛋白，但敲除基因，意外地發(fā)現(xiàn)雄性小鼠在減數(shù)分裂中沒有明顯異常，而出現(xiàn)精子核濃縮及尾部延伸缺陷而不育[20]。是Manchette 結(jié)構(gòu)和功能以及調(diào)控精子形成的關(guān)鍵基因，MEIG1蛋白分子量10 kDa，包含絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的多重一致序列。Meig1缺失小鼠精子細(xì)胞中Man-chette被破壞，從而損害了Manchette內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(intra-manchette transport, IMT)系統(tǒng)，導(dǎo)致精子頭部成形和鞭毛形成障礙[20]。此外，PACRG (the Parkin co- regulated gene)是一種影響軸絲外周雙聯(lián)微管形成的蛋白，MEIG1可以與PACRG直接相互作用，提示兩者通過一個共同的機(jī)制調(diào)節(jié)精子形成，MEIG1可能穩(wěn)定PACRG或作為PACRG作用的輔助因子。

5 軸絲發(fā)育相關(guān)蛋白

5.1 中央微管發(fā)育相關(guān)蛋白

(cilia and flagella-associated protein)編碼蛋白在進(jìn)化上高度保守，包含ARM-repeat和AH/BAR兩個結(jié)構(gòu)域。其在睪丸中含量較高，定位于人類精子鞭毛中段，在成年小鼠睪丸中，開始表達(dá)于減數(shù)分裂期，并在隨后階段表達(dá)量顯著增加。CFAP69對于鞭毛的裝配和穩(wěn)定是必需的，它的缺失會導(dǎo)致軸絲缺陷[21]，并呈現(xiàn)出MMAF表型。突變精子中軸絲的中心對復(fù)合體(central pair complex, CPC)蛋白SPAG6和SPEF2減少，表明CFAP69可能參與了CPC的裝配，CFAP69可能通過參與IFT而參與精子尾部形成和CPC組裝。此外，在精子形成過程中，CFAP69對于精子頭部的形成也是至關(guān)重要的。

SPEF2 (sperm flagellar 2)是另一種影響中央微管發(fā)育的蛋白，在精子細(xì)胞伸長階段對精子形成至關(guān)重要[22]。SPEF2含有1822個氨基酸，其N-端有CH結(jié)構(gòu)域，C-端有IFT20結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SPEF2能與IFT20相互作用，并定位于高爾基復(fù)合體和Man-chette[23]。突變精子主要的形態(tài)學(xué)缺陷是鞭毛主段的CPC完全缺失，形成“9+0”構(gòu)象，表明SPEF2在正常軸絲形成中具有重要作用[22]。SPEF2在功能上與CFAP69相互作用，突變精子中SPEF2蛋白水平顯著降低或缺失，突變精子中CFAP69也出現(xiàn)減少。SPEF2可能通過特定的機(jī)制與CFAP69一起參與精子鞭毛CPC的組裝。

此外，ARMC2 (armadillo repeat containing 2- encoding gene)也影響中央微管的發(fā)育。位于6號染色體上，包含18個外顯子，編碼蛋白含867個氨基酸[24]，這是一種ARM (armadillo)蛋白，優(yōu)先在睪丸中表達(dá)，屬于含有ARM重復(fù)序列蛋白家族，由12個ARM重復(fù)序列組成，兩側(cè)分別是獨(dú)特的C端和N端結(jié)構(gòu)域。ARMC2對人和小鼠精子尾部發(fā)育至關(guān)重要，雙等位基因突變呈現(xiàn)出典型的MMAF表型。在突變個體和小鼠中，CPC中SPAG6和SPEF2蛋白缺失[25]，表明ARMC2參與了CPC的組裝和穩(wěn)定，其對精子鞭毛的結(jié)構(gòu)和裝配是必需的。

5.2 外周微管發(fā)育相關(guān)蛋白

動力蛋白被錨定在外周微管上，其產(chǎn)生的力使微管彼此滑動，而連接蛋白將微管固定在適當(dāng)位置，通過防止微管滑動，將動力蛋白產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為鞭毛的彎曲運(yùn)動。連接蛋白–動力蛋白調(diào)節(jié)復(fù)合物(nexin-dynein regulatory complex, N-DRC)是相鄰的外周雙聯(lián)微管之間的細(xì)絲，由多達(dá)11種蛋白質(zhì)組成，除連接相鄰?fù)庵茈p聯(lián)微管以防止微管滑動外，N-DRC還可以調(diào)節(jié)動力蛋白的運(yùn)動活性[26]。

(T-complex associated testis expressed 1)是一種進(jìn)化上保守的基因，存在于含有鞭毛的所有真核生物中。TCTE1是衣藻N-DRC組分DRC5的同源物，是一種從衣藻DRC5到哺乳動物進(jìn)化上保守的軸絲蛋白，定位于N-DRC。TCTE1編碼蛋白含498個氨基酸，C端具有富含亮氨酸重復(fù)區(qū)(leucine rich repeat, LRR)結(jié)構(gòu)域，LRR結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)的相互作用。Tcte1缺失小鼠精子尾部向一側(cè)收縮，精子形成圓形的運(yùn)動路徑[27]。此外，敲除精子的ATP顯著減少，前向運(yùn)動減弱，精子內(nèi)的能量代謝降低。

5.3 放射輻發(fā)育相關(guān)蛋白

RS為軸絲的組分，是一種與鞭毛運(yùn)動調(diào)節(jié)有關(guān)的T形蛋白質(zhì)復(fù)合物，具有一個細(xì)長的“莖”與外周雙聯(lián)微管相連，以及一個球狀的“頭”向中央微管延伸。在衣藻中發(fā)現(xiàn)了5種RS頭蛋白：RSP1、RSP4、RSP6、RSP9和RSP10，其在小鼠和人類中是保守的，分別對應(yīng)于RSPH1、RSPH4A、RSPH6A、RSPH9和RSPH10B。

其中，(radial spoke head 6 homolog A)為一種進(jìn)化上保守的基因，是衣藻RSP6的同源物。RSPH6A對小鼠精子鞭毛裝配是必需的。RS受損，軸絲可變得不穩(wěn)定并停止伸長，線粒體和纖維鞘形成隨即終止?；蚯贸∈缶佣糖也粍?，軸絲可以伸長，但在附屬結(jié)構(gòu)形成之前被破壞，并且出現(xiàn)Manchette移除障礙，導(dǎo)致核周環(huán)異常地收緊細(xì)胞核，造成精子棒狀頭部。此外，RSPH9在敲除精子鞭毛中缺失，表明RSPH6A與RSPH9相互作用對于將RSPH9整合到鞭毛中很重要[28]。敲除小鼠表型與敲除小鼠相似，具有異常的軸絲結(jié)構(gòu)，如RS和中央微管對缺失[29]，并且具有畸形的頭部和發(fā)育不良的鞭毛。

5.4 內(nèi)外動力蛋白臂發(fā)育相關(guān)蛋白

DNAH1 (dynein axonemal heavy chain 1)是一個編碼軸絲IDA重鏈的蛋白，其基因突變可顯著降低蛋白表達(dá)，并導(dǎo)致MMAF表型，雖然DNAH1缺失不影響ODA，但I(xiàn)DA完全雜亂、中央微管對缺失、FS畸形[30]。與DNAH1相似，DNAH2也是一種睪丸特異性蛋白，是軸絲內(nèi)動蛋白臂重鏈(dynein heavy chains, DHC)的主要組分，是動力蛋白-F的一個重要亞基。突變精子中DNAH2水平顯著降低，IDA缺失，MS也受到破壞，精子喪失活力[31]?；蛲蛔兂尸F(xiàn)出MMAF表型，表明DNAH2是與MMAF相關(guān)的一種新的候選蛋白。對DNAH1和DNAH2的研究揭示了DHC家族蛋白在維持鞭毛結(jié)構(gòu)完整性方面的重要作用，并提示其他功能不明的DHC編碼基因也可能參與了精子鞭毛缺陷表型。

與僅影響軸絲IDA重鏈形成的DNAH1和DNAH2不同，C11orf70 (the chromosome 11 open- reading frame 70)缺陷不僅導(dǎo)致1型和2型ODAs缺失，還造成I2組IDAs的DNALI1缺失和I3組IDAs的DNAH6缺失，這表明C11orf70參與了精子鞭毛中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)動力蛋白臂的組裝[32]，其突變引起了組裝的中斷，導(dǎo)致ODAs和IDAs缺失，造成了鞭毛不動。此外，C11orf70與細(xì)胞質(zhì)ODA/IDA裝配因子DNAAF2直接相互作用，表明C11orf70可能是一個細(xì)胞質(zhì)預(yù)組裝因子，參與了動力蛋白組分向軸絲轉(zhuǎn)運(yùn)。

與C11orf70相似，PIH1D3 (PIH1 domain con-taining3)也是一種動力蛋白臂細(xì)胞質(zhì)預(yù)組裝因子，并且缺失也會導(dǎo)致ODAs和IDAs同時缺失。PIH1D3含有PIH1結(jié)構(gòu)域，它在生精細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)，其mRNA在粗線期精母細(xì)胞中含量最高。作為一種具有獨(dú)特功能的新型軸絲動力蛋白預(yù)組裝因子(dynein axonemal asse-mbly factor, DNAAF)，PIH1D3可以促進(jìn)軸絲ODAs和IDAs的HCs和ICs在小鼠精子細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定和組裝。PIH1D3也是第一個發(fā)現(xiàn)的ICs細(xì)胞質(zhì)預(yù)組裝以及“9+2”微管結(jié)構(gòu)所需的DNAAF。敲除小鼠精子不動并且十分脆弱，其軸絲“9+2”微管結(jié)構(gòu)紊亂，ODAs和IDAs缺失[33]。由此可見，PIH1D3是通過穩(wěn)定和促進(jìn)ODA和IDA的形成促成了精子細(xì)胞中動力蛋白復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中的預(yù)組裝。

6 外周致密纖維發(fā)育相關(guān)蛋白

ODF是發(fā)現(xiàn)的2種主要細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)之一，每根ODF都與1個雙聯(lián)微管(doublets of microtubules, DMTs)對應(yīng)。已知和是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的3種編碼ODF的基因，并且3者之間存在著密切的聯(lián)系。基因位于人染色體8q22上[34]，主要編碼27 kDa ODF蛋白，富含半胱氨酸和脯氨酸。ODF1既可通過N端亮氨酸拉鏈基序自我聯(lián)合，也可通過該基序與ODF2亮氨酸拉鏈相互作用。單倍體精子細(xì)胞中在減數(shù)分裂后期轉(zhuǎn)錄，其翻譯似乎緊隨著轉(zhuǎn)錄進(jìn)行?；?，又稱為位于人染色體9q34上[35]，主要編碼84 kDa ODF蛋白。人類和大鼠外顯子在核苷酸水平上有90%相同，由該外顯子編碼的氨基酸序列則100%相同[35]。ODF2有兩個亮氨酸拉鏈，在長形精子細(xì)胞ODF沿著軸絲裝配過程中，ODF2通過上游C端亮氨酸拉鏈與ODF1 N端亮氨酸拉鏈發(fā)生強(qiáng)烈特異性相互作用，其第二個亮氨酸拉鏈可能與其他ODF或精子尾部結(jié)構(gòu)蛋白相互作用。因此，ODF2可能是ODF形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵參與者。編碼一種約110 kDa ODF卷曲螺旋蛋白[36]，其中心區(qū)域幾乎完全由卷曲螺旋組成，而在N端和C端，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)被非螺旋區(qū)域打斷。ODF3具有3個亮氨酸拉鏈區(qū)域，ODF2和ODF3均可形成纖絲支架，最終形成精子尾部外周致密纖維。

上述ODF1、ODF2和ODF3均是ODF的結(jié)構(gòu)蛋白，Tssk4則是通過與Odf2相互作用影響ODF的形成。TSSK (testis specific serine/threonine protein kinase)家族在精子發(fā)生和精子形成中起重要作用，其由Tssk1、Tssk2、Tssk3、Tssk4/5及Tssk6 5個成員組成，除Tssk3主要在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)外，其他成員的表達(dá)僅限于減數(shù)分裂后生殖細(xì)胞，且Tssk4與Tssk5是同一蛋白[37]。Tssk4屬于TSSK家族，它是維持精子鞭毛結(jié)構(gòu)完整性所必需的。Tssk4和Odf2位于精子鞭毛主段，通過磷酸化相互調(diào)節(jié)，這種相互調(diào)節(jié)可能保持一個正反饋回路，活性的Tssk4可以改變Odf2磷酸化狀態(tài)以調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動和結(jié)構(gòu)。反之，Odf2可以增強(qiáng)Tssk4自身磷酸化活性[38]，而Tssk4又可以通過自身磷酸化活性維持自身的激酶活性[37]。此外，Odf2可以將Tssk4蛋白募集到ODFs上。敲除的精子對剪切力更敏感，精子尾部超微結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，在中段-主段連接處出現(xiàn)彎曲，精子運(yùn)動能力降低。

此外，MNS1 (meiosis-specific nuclear structural protein 1)缺失也會導(dǎo)致ODF形成障礙。MNS1是一種約60 kDa的卷曲螺旋蛋白，在晚期粗線期精母細(xì)胞、雙線期精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中大量表達(dá)[39]，對精子形成至關(guān)重要。MNS1是精子鞭毛必不可少的組分，精子鞭毛的裝配需要MNS1。MNS1單體彼此相互作用并且在異位表達(dá)時能夠形成纖維聚合物，在鞭毛中MNS1組裝成絲狀結(jié)構(gòu)。MNS1缺失的精子鞭毛中，特征性的“9+2”微管排列和ODF被完全破壞。此外，缺失MNS1，精子的產(chǎn)量顯著降低，產(chǎn)生不動的精子，且有異常的短尾。

7 線粒體鞘發(fā)育相關(guān)蛋白

驅(qū)動蛋白是主要的正端導(dǎo)向微管馬達(dá)，它負(fù)責(zé)將細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合物以及mRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域[40]。驅(qū)動蛋白I馬達(dá)分子由兩條驅(qū)動蛋白重鏈(kinesin heavy chains, KHCs)和兩條驅(qū)動蛋白輕鏈(kinesin light chain, KLCs)組成。其中，KLC3是目前唯一已知的驅(qū)動蛋白輕鏈，它在雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂后表達(dá)并在精子尾部中段聚積。KLC3位于ODF和線粒體之間，并具有典型的KLC結(jié)構(gòu)域特征，包括保守的7肽重復(fù)序列(heptad repeat, HR)和34肽重復(fù)序列(tetratricopeptide repeats, TPRs)[41]，其HR區(qū)與ODF1的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域相互作用[42]，而TPR區(qū)可能直接或通過銜接分子Caytaxin與線粒體外膜蛋白VDAC2結(jié)合[43]，因此KLC3作為錨定蛋白將ODF和線粒體結(jié)合在一起。KLC3與線粒體結(jié)合正值線粒體從精子細(xì)胞邊緣移動到正在發(fā)育的中段，并且KLC3能以微管依賴的方式引起線粒體聚集形成聚集體，這些表明KLC3在中段形成中起著重要作用，其可能通過協(xié)助精子中段MS的形成參與了精子發(fā)生。

與KLC3不同，在線粒體中MFN2 (mitofusin 2)本身就是一種外膜蛋白。MFN2影響MS的形成，它不僅參與線粒體網(wǎng)絡(luò)的融合、維持和運(yùn)轉(zhuǎn)，同時也參與調(diào)節(jié)線粒體與亞細(xì)胞細(xì)胞器之間的聯(lián)系。MFN2和MNS1均是精子鞭毛的一個組分，它們在鞭毛的生物發(fā)生和功能中起作用。研究發(fā)現(xiàn)，在精子發(fā)生過程中，MFN2與MNS1通過相互作用形成了一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，并共定位于精子鞭毛[44]。在生精細(xì)胞中，MFN2位于線粒體內(nèi)，與精子鞭毛中段的發(fā)育相關(guān)。

此外，CFAP251 (cilia and flagella-associated pro-tein 251)也可影響MS的發(fā)育。CFAP251又稱WDR66，它在睪丸中特異性表達(dá)，其編碼蛋白含1149個氨基酸，有9個WD重復(fù)序列，N端有富含Glu的酸性結(jié)構(gòu)域，C端有鈣結(jié)合EF-hand結(jié)構(gòu)域。CFAP251是鈣調(diào)蛋白和RS相關(guān)復(fù)合體的組分，位于軸絲外周雙聯(lián)微管內(nèi)表面，與DNAH1相鄰。DNAH1與CFAP251可相互作用，兩者相互作用受損可以破壞RS3與IDA3之間的連接[45]。盡管位于軸絲外周雙聯(lián)微管上，但CFAP251可以影響IFT，而IFT通常在線粒體募集之前會立即將annulus環(huán)移動并使其遠(yuǎn)離細(xì)胞核，IFT通過軸絲和輔助鞘間的一系列相互作用、通過對軸絲剛性的機(jī)械作用、或在裝配過程中將特定蛋白導(dǎo)向軸絲的外表面來限定MS的末端。缺失呈現(xiàn)出MMAF表型[45]，其突變精子的線粒體被募集到中段，但不能沿軸絲擴(kuò)展，造成MS發(fā)育不良，可見到線粒體密度非常低的短MS。CFAP251是MS沿著精子鞭毛中段延伸所必需的，它可能通過啟用特定的IFT而參與MS-FS連接的定位。

8 纖維鞘發(fā)育相關(guān)蛋白

FSIP2 (fibrous sheath-interacting protein 2)在精子鞭毛形成過程中起著重要作用。突變精子超微結(jié)構(gòu)異常，精子中段較厚，有多余的殘余體，并且DMTs和ODFs解體[46]。突變精子的活力明顯受損，并可以引起MMAF表型，F(xiàn)SIP2可能是MMAF相關(guān)的弱畸精子癥的一個新的蛋白。FSIP2和激酶A錨定蛋白4 (A-kinase anchor protein 4, AKAP4)之間存在相互作用，而AKAP4和激酶A錨定蛋白3 (A-kinase anchor protein 3, AKAP3)是FS中最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，因此FSIP2可能與AKAP3和AKAP4一起參與了FS的形成。

PKA全酶由兩個調(diào)控亞基(RIα和RIIα)和兩個催化亞基(Cα和Cα2)組成。PKA的R亞基還包含1個RII二聚/對接(RII dimerization/docking, R2D2)結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可與激酶A錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins, AKAPs)上的短肽區(qū)相互作用。ROPN1 (Ropporin 1)、ROPN1L(ROPN1-like)是包含R2D2結(jié)構(gòu)域的R2D2蛋白質(zhì)[47]，兩者在功能上存在相互補(bǔ)償。AKAP可能具有雙重信號傳導(dǎo)功能，除與PKA相互作用外，還通過兩性螺旋結(jié)構(gòu)域與ROPN1和ROPN1L結(jié)合[48]，以調(diào)節(jié)精子活力。R2D2蛋白ROPN1和ROPN1L通過依賴PKA的信號通路參與精子活力調(diào)控[47]。和突變可導(dǎo)致FS完整性、精子活力和PKA依賴性信號傳導(dǎo)通路的缺陷。ROPN1和ROPN1L對于正常的FS結(jié)構(gòu)和功能是必需的。上述FSIP2、ROPN1和ROPN1L都是通過與FS中的結(jié)構(gòu)蛋白相互作用而發(fā)揮作用，而FS39、Als2cr12和Mtsga10 3種蛋白則是FS的組成成分。

FS39 (fibrous sheath)是一種39 kDa的FS中間絲相關(guān)蛋白，僅表達(dá)于睪丸單倍體生殖細(xì)胞[49]。FS39 mRNA具有生殖細(xì)胞特異性，在精子形成第3~14步表達(dá)，在頂體期(第8~12步)達(dá)到高峰，F(xiàn)S39 mRNA受翻譯調(diào)控，在成熟期(第13~14步)首次檢測到該蛋白。FS39具有纖維鞘蛋白的特點(diǎn)：高不溶性、富含天冬氨酸和谷氨酸，并含有可能在FS組裝和功能中起關(guān)鍵作用的特定磷酸化位點(diǎn)。FS39位于FS的縱柱中，其分布模式與AKAP82相同。AKAP82是將PKA錨定在FS上，在cAMP作用下，激酶的催化亞基被釋放并自由磷酸化其底物。AKAP82被合成為細(xì)胞質(zhì)中不活躍的前體，通過軸絲向下運(yùn)輸?shù)窖b配位點(diǎn)，隨后被切割為成熟蛋白，F(xiàn)S39在氨基酸11處含有1個特定的酰胺化位點(diǎn)，而酰胺化位點(diǎn)存在于前體蛋白的切割位點(diǎn)上，因此FS39可能經(jīng)過AKAP82類似的處理轉(zhuǎn)運(yùn)到FS位點(diǎn)上。

Als2cr12 (amyotrophic lateral sclerosis 2 chro-mosome region candidate 12)是一種新的生精細(xì)胞特異性蛋白。產(chǎn)生短Als2cr12 (Als2cr12-S)和長Als2cr12 (Als2cr12-L)兩種轉(zhuǎn)錄物[50]，其中編碼蛋白含245個氨基酸，分子量28 kDa，在睪丸體細(xì)胞表達(dá)或在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中均有表達(dá)；而編碼蛋白含383個氨基酸、預(yù)計(jì)分子量為45 kDa，在雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)，是精子鞭毛主段FS的組分，Als2cr12-L在FS發(fā)育中起著重要作用。

(mus testis-specific gene antigen 10)位于小鼠1號染色體B帶，在不同物種中高度保守，基因序列在小鼠與人之間同源性為89%，氨基酸序列同源性為94%[51]。Mtsga10含有一種特定的ERM結(jié)構(gòu)域(又稱為結(jié)構(gòu)域，其命名源于最初在該結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)的4種蛋白：條帶4.1 (F)、Ezrin (E)、Radixin (R)和Moesin (M)，即肌球蛋白、埃滋蛋白、根蛋白和膜突蛋白[52])，Mtsga10的肌球蛋白結(jié)構(gòu)域是形成細(xì)絲所必需的，在FS形成中發(fā)揮作用。Mtsga10 mRNA最早在精子發(fā)生減數(shù)分裂后期檢 測到，被翻譯成65 kDa的精子細(xì)胞蛋白，隨后在 成熟精子中被加工成27 kDa的FS結(jié)構(gòu)蛋白，并保存于精子尾部主段[51]。人(testis-specific gene antigen 10)是小鼠的同源基因，位于人染色體2q11.2上。

除上述蛋白外，還發(fā)現(xiàn)通過其他機(jī)制影響FS形成的蛋白，如ENO4 (enolase 4)。眾所周知，糖酵解是精子中ATP的主要來源，精子中的糖酵解酶主要位于精子鞭毛的主段。在糖酵解的倒數(shù)第3步，烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。隨后在丙酮酸激酶的催化作用下，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，并伴有ATP生成。而ENO4是小鼠精子中發(fā)現(xiàn)的一種新型精子特異性烯醇化酶，位于精子鞭毛的主段，也是小鼠精子中主要的烯醇化酶。ENO4在精子中提供了大部分的烯醇化酶活性，它是FS正常裝配所必需的[53]。敲除小鼠精子活力、ATP水平和烯醇化酶活性顯著降低，F(xiàn)S組分無序聚集，常出現(xiàn)1個或3個縱柱，且環(huán)形肋組織結(jié)構(gòu)和厚度不規(guī)則[53]，說明ENO4對FS的形成具有重要的影響。此外，位于中段–主段連接處的annulus環(huán)也出現(xiàn)缺失、退化或錯位。

最后，CFAP157 (cilia and flagella-associated protein 157)是一種基底體蛋白，定位于基底體，可以與微管蛋白以及中心體蛋白CAP350相互作用[54]。CFAP157僅在男性生殖細(xì)胞中具有關(guān)鍵功能，它在精子運(yùn)動和鞭毛形態(tài)發(fā)生中起作用。CFAP157作用于哺乳動物發(fā)育中的精子，以確保形成一個超微結(jié)構(gòu)正常的軸絲以及一個具有功能性的中段[55]。敲除精子的中段有多余的細(xì)胞質(zhì)和聚集的線粒體，造成中段異常擴(kuò)張和無序，并出現(xiàn)軸絲環(huán)[55]。缺失精子的頭部相對于鞭毛軸彎曲成較小的角度，因此，鞭毛擺動不能將精子打入卵細(xì)胞內(nèi)，而是沿著卵細(xì)胞表面，遠(yuǎn)離卵。CFAP157確切的作用機(jī)制目前尚不清楚，但CFAP157對于FS的形成具有重要影響。

9 結(jié)語與展望

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國不孕不育人口已超過500萬，約占育齡人口比例的12.5%，但其治愈率卻不到30%。在不孕不育的育齡夫婦中，由男方因素引起的不育占了50%。男性不育是一種具有高度異質(zhì)性表型的多因素復(fù)雜疾病，其中，遺傳因素占了至少15%，包括染色體和單基因改變[56]，其常見的臨床表現(xiàn)之一是少、弱、畸形精子癥(oligo-astheno-teratozoos-permia, OAT)。目前，輔助生殖技術(shù)(assisted repro-ductive technologies, ART)是治療男性不育最有效的手段之一，包括試管嬰兒(fertilization, IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm in-jection, ICSI)等，但同時存在諸多的弊端，例如通過IVF和ICSI出生的嬰兒遺傳缺陷幾率有顯著增加[57]。生殖系基因治療(germ line gene therapy)是一種十分具有前景的治療方法，揭示生育相關(guān)基因、蛋白的功能與特性是生殖系基因治療的前提。在導(dǎo)致男性不育的基因突變中，有很多是影響精子發(fā)育的基因，尤其是影響尾部發(fā)育的基因，其突變對精子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。目前已鑒定出了很多影響精子尾部發(fā)育的蛋白，但這些蛋白缺失所引起的精子形態(tài)和功能異常僅能解釋30%~60%的臨床男性不育病例，還有很多遺傳學(xué)病因及致病機(jī)制尚不清楚，需要更深入的研究。揭示男性不育的遺傳病因十分重要，這不僅可以在分子水平上更準(zhǔn)確地闡明不育癥的發(fā)病機(jī)制，還可以為今后的基因診斷和基因治療奠定基礎(chǔ)。本文根據(jù)精子尾部的超微結(jié)構(gòu)，對影響精子尾部各個部分發(fā)育的蛋白近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望有助于讀者對影響精子尾部發(fā)育相關(guān)的蛋白有一個系統(tǒng)性認(rèn)識。隨著生殖醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的男性不育患者有望能夠解決生育難題。

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Research progress of proteins related to sperm tail development

Yanan Zhong, Changmin Niu, Mengmeng Xia, Ying Zheng

The structure of sperm tail is closely related to its motor function, which directly determines whether the sperm can be normally transported to fallopian tube and fertilize the ovum. The formation and development of sperm tail is a very complex process, which is finely regulated by various kinds of proteins. Research finds that defects of various sperm tail development related proteins can lead to oligospermia, asthenozoospermia and teratospermia. Based on the ultrastructure of sperm tail, we summarize the recent research progress of the proteins related to sperm tail development, thereby providing the theoretical basis and practical possibility for the diagnosis and treatment of male infertility.

sperm tail; development; protein; research progress

2019-12-25;

2020-04-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81871205)和江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：BK20131230)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81871205), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20131230)]

鐘亞楠，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: 415833840@qq.com

鄭英，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: yzzkl@163.com

10.16288/j.yczz.19-309

2020/5/11 14:06:09

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200509.1617.002.html

(責(zé)任編委: 苗龍)