禽畜抗生素維吉尼亞霉素研究進展

仝倩倩，李亞亮，王順昌，顏守保

(1.淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 淮南 232038；2.資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點實驗室，安徽 淮南 232038)

0 引言

1955年[1]，De Somer及Van Dijck從比利時土壤中分離并純化獲得一株“899”號菌株，即維吉尼亞霉素(virginiamycin，VGM)產(chǎn)生菌維吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae).該藥物抗菌譜較窄，主要抗革蘭氏陽性菌，如八疊球菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌等，目前尚未發(fā)現(xiàn)耐藥菌.VGM在動物腸道內(nèi)不易被吸收，毒性小，被廣泛用于預(yù)防及治療豬下痢和雞壞死性腸炎等疾病，并能針對性地殺死動物腸道內(nèi)有害的革蘭氏陽性菌，緩解腸道蠕動，從而提升飼料利用率，是業(yè)界公認的安全無毒畜禽抗生素[2，3].

1 結(jié)構(gòu)特點

VGM是由兩種成分(M及S因子)自然組合的鏈陽性菌素，M1為大環(huán)內(nèi)酯，S1為環(huán)狀多肽，其中M∶S質(zhì)量比約為(70%～80%)∶(20%～30%).M1分子式：C28H35N3O7；S1分子式：C43H49N7O10.其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

M與S兩因子同時存在時，協(xié)同作用強，特別是當(dāng)M∶S約為7∶3時，殺菌效果最好.但M或S因子單獨存在時，僅表現(xiàn)出抑菌作用.如，M因子單獨抑制金黃色葡萄球菌時的最小抑菌濃度為0.25 μg/mL，S因子單獨抑制藤黃微球菌時為4 μg/mL；二者共同存在時僅為0.125 μg/mL.

2 理化性質(zhì)及在售產(chǎn)品

作為一種非晶態(tài)褐黃色粉末，VGM有著特殊的臭味，低水溶性(563 μg/mL)，易溶于甲醇、乙醚及氯仿等多種有機溶劑.由于VGM在堿性溶液中及紫外光下會很快失活，因此VGM保存時需要避光、干燥[4].

VGM通常作為飼料預(yù)混劑出售，其載體多為碳酸鈣、大豆粉、米糠、玉米粉及黃豆餅粉等.目前商用預(yù)混劑的濃度各不相同，包括Stafac?1 000、500、50、20及2.2%等幾種劑型，即每kg含1 000、500、50、20及2.2 gVGM.低濃度的預(yù)混劑能夠促進飼料吸收，增加家禽體重.中、高濃度的可以用于控制并治療豬下痢及雞壞死性腸炎.

3 安全性及作用

VGM由M及S因子構(gòu)成，目前還未報道有耐藥菌株，VGM對人類健康的風(fēng)險是可以忽略的[5].歐盟動物營養(yǎng)科學(xué)委員會[6](Scientific Committee on Animal Nutrition，SCAN)認為，動物使用VGM不會引發(fā)耐藥性，動物微生物不會轉(zhuǎn)移到人消化道微生物，從而危害人類藥物的使用；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性不會在飼養(yǎng)動物之間轉(zhuǎn)移；也不會從動物傳遞給人類.Acar[7]等認為沒有嚴(yán)格的證據(jù)證明動物中使用VGM會在人類中產(chǎn)生抗性菌，進而導(dǎo)致臨床感染.

VGM可用作動物的生長劑，只需添加微量的VGM就能呈現(xiàn)較好的促生長及提高動物飼料利用率的作用.Gadde[8]等在研究VGM對肉雞生長性能時發(fā)現(xiàn)，在雞膳食中補充20 g/t的維吉尼亞霉素，0 d～21 d肉雞的體重增加了10.1%(p<0.05).此外，VGM主要抑制腸道內(nèi)的革蘭氏陽性菌，但它不能通過革蘭氏陰性菌的細胞膜，所以對革蘭氏陰性菌幾乎沒有影響[9].VGM能夠減少了產(chǎn)氣莢膜梭菌的腸道定植，并降低了由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎的嚴(yán)重性和死亡率[10].另外，VGM還可有效降低動物肝膿腫的發(fā)病率[11].

4 發(fā)酵生產(chǎn)工藝

4.1 菌種選育

微生物是發(fā)酵工業(yè)的靈魂，因此，微生物菌種選育工作一直是研究人員關(guān)注的首要問題.

目前，VGM產(chǎn)生菌主要有兩種：維吉尼亞鏈霉菌(S.virginiae)[12]及灰綠鏈霉菌(S.griseoviridus)[13].生產(chǎn)VGM的出發(fā)菌株為S.virginiaeATCC 13161，它是美國輝寶公司經(jīng)過幾十年的時間，通過比較S.virginiae孢子產(chǎn)生能力、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及VGM產(chǎn)量，從數(shù)百萬株鏈霉菌中通過各種物理化學(xué)誘變育種方法結(jié)合各種抗性篩選手段分離篩選出來的[14].

1994年李向前[13]，通過紫外照射及亞硝基胍處理S.griseoviridus400E-2菌株后，獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)株S.griseoviridusLR-0940，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后，其生物效價是原菌株30的倍.2007年陳睦等[15]從北京郊區(qū)采集的土壤樣品中分離純化出一株產(chǎn)VGM的菌株Streptomycessp.X-435，紫外誘變后出現(xiàn)三種菌落形態(tài)，最終確定正突變株為草帽型菌落，并進一步篩選獲得一株穩(wěn)定突變株F5-25-U-28，其效價高于出發(fā)菌株將近20倍.2018年周躍慧[16]等借助物理誘變與鏈霉素抗性篩選相結(jié)合的方法選育維吉尼亞霉素高產(chǎn)突變株，結(jié)果顯示微波誘變效果較好，正突變率高達32.83%；并獲得一株高產(chǎn)菌株MW 178(146.72 ±11.80 μg/mL)，較出發(fā)菌株(21.24±1.34 μg/mL)提高了約6倍.同年，筆者[12]借助基因組重排結(jié)合硫酸鏈霉素篩選技術(shù)，經(jīng)過5輪基因組重排，成功獲得一株VGM高產(chǎn)突變株G5-103，產(chǎn)量為251 mg/L.

4.2 發(fā)酵原料

發(fā)酵原料包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等，對產(chǎn)物的代謝影響很大.張兆利等[17]在專利中公開了一種以StreptomycesvirginiaeMAFF 10-06014為菌種，生物合成VGM的廉價培養(yǎng)基，其中氮源包括黃豆餅粉、玉米漿、豆粕等，濃度為2%～10%；碳源包括淀粉、蔗糖、葡萄糖等，濃度為4%～8%；硫酸鹽包括硫酸錳、硫酸亞鐵等，濃度為0.000 5%～0.005%；另外還有0.1%～1.0%的碳酸鈣，調(diào)節(jié)初始pH為4.0～8.0之間.在該條件下，VGM中M因子的產(chǎn)量在1 g/L以上，最高達1.5 g/L.韓風(fēng)華[2]在專利中公開了一種維吉尼亞鏈霉菌ACCC40768合成VGM的方法，包括斜面、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基具體成分及培養(yǎng)條件，并在發(fā)酵前期12 h～24 h加入乙酸鈉和丙酸鈉作為前體，在此條件下，VGM最大產(chǎn)量為3 500 μg/mL.任勇[18]在專利中公開了一種維吉尼亞鏈霉菌合成VGM的種子、發(fā)酵培養(yǎng)基，并同時公開了了發(fā)酵過程中的補料方法，包括補油、補水、補糖等.

4.3 代謝調(diào)控

不同菌株和培養(yǎng)條件對VGM的產(chǎn)量和生物量影響顯著.在鏈霉菌的發(fā)酵中，有一些自動調(diào)節(jié)劑(包括A-因子，Gr?fe因子，virginiae butanolides，inducing material等)，可以以nM級別的濃度(10 nmg/L～100 nmg/L)，誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生.如virginiae butanolides能夠在納克每毫升濃度下誘導(dǎo)維吉尼亞鏈霉菌合成VGM[19].

Yang[20]等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VGM的生產(chǎn)屬于非生長偶聯(lián)型，遂通過兩步優(yōu)化法來提高VGM的產(chǎn)量.具體地，通過研究培養(yǎng)基最佳成分及濃度，延長維吉尼亞鏈霉菌生長期，從而獲得較高濃度生物量；此外，在發(fā)酵過程中添加了自動調(diào)節(jié)劑virginiae butanolides-C，用于提高VGM的產(chǎn)量.Shioya[21]等研究了攪拌速度對VGM產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)提高轉(zhuǎn)速對依賴于溶解氧(DO)的抗生素生產(chǎn)有促進作用.以低于450 rpm的速度開始培養(yǎng)維吉尼亞鏈霉菌，直至DO達到80%，然后調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，使DO維持在80%，并且加入自動調(diào)節(jié)劑virginiae butanolides-C，最終產(chǎn)量可達到399 mg/L，是未調(diào)整前的1.8倍.

Dzhavakhiy等[22]利用之前研究中獲得的一株突變株S.virginiaeVKM AC-2738D，將其從搖瓶培養(yǎng)擴大至中試規(guī)模(100 L)的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，并評價了合成吸附樹脂原位分離發(fā)酵液中VGM的可能性.發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化pH、溶解氧情況下，連續(xù)添加蔗糖對VKM AC-2738D進行分批補料發(fā)酵，最終VGM產(chǎn)量達到4.9 g/L.在測試的4種樹脂中，Diaion?HP21吸收了98.5%的VGM，進一步簡化了提取程序，最終VGM總量達5.6 g/L.

周躍慧[16]等在利用微波誘變獲得的一株突變株MW178進行發(fā)酵時，在初始階段加入適當(dāng)濃度的氯化鑭，發(fā)現(xiàn)VGM產(chǎn)量得到顯著提高，從146.72 μg/mL提高至180.01 μg/mL，提高了22.69%，表明在發(fā)酵初始階段，加入適當(dāng)濃度的稀土元素鑭有利于VGM的積累.

5 小結(jié)

VGM是一種窄譜、高效安全的新型抗生素，具有良好的環(huán)境及社會效益.雖然國內(nèi)外有VGM的生產(chǎn)報道，但市場基本被美國輝寶公司占領(lǐng)，國內(nèi)并無VGM的生產(chǎn)報道.雖然VGM的發(fā)現(xiàn)較早，但仍存在很多問題.用傳統(tǒng)誘變育種方法進行VGM菌種選育雖已有很多報道，并取得了一定的進展，但抗生素整體效價仍較低，今后可引入一些新穎的誘變育種技術(shù)，如常壓室溫等離子體誘變、離子束誘變、基因工程育種等技術(shù)提高維吉尼亞鏈霉菌的基因突變頻率，并結(jié)合代謝調(diào)控手段，獲得穩(wěn)定經(jīng)濟的突變株.其次，未來需要更加深入地探索和研究不同的發(fā)酵原料對VGM產(chǎn)量的影響，并適當(dāng)開發(fā)一些傳統(tǒng)原料以外的新原料，拓寬其原料種類.另外，研發(fā)者可著手考察發(fā)酵過程中泡沫、CO2、補料等因素對VGM發(fā)酵的影響.最后，優(yōu)化VGM發(fā)酵液下游分離純化工藝也是以后的研究方向之一.隨著研究的深入，VGM對畜牧業(yè)的發(fā)展將會發(fā)揮更重要的作用.