益生菌檢測在食品微生物實驗教學(xué)中的應(yīng)用

劉麗艷，王 文，蘇健裕

(華南理工大學(xué)輕工與食品實驗教學(xué)中心，食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州510640)

0 引言

食品微生物學(xué)是一門具有較強實驗性的專業(yè)基礎(chǔ)課，對于培養(yǎng)食品領(lǐng)域人員的食品微生物檢驗技術(shù)、食品質(zhì)量控制能力及衛(wèi)生安全意識具有重要意義?！拔⑸飳W(xué)實驗”是微生物學(xué)教學(xué)不可分割的一部分，同時也是所有食品和生命科學(xué)研究的實驗基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的實驗教學(xué)，重點培養(yǎng)學(xué)生掌握單項實驗技能和熟練實驗操作，如細菌染色及顯微觀察、霉菌菌種培養(yǎng)及觀察、酵母計數(shù)和大小測定等，較好地完成了理論課知識的驗證。但由于實驗課學(xué)時、實驗內(nèi)容安排順序和關(guān)聯(lián)性等因素限制，課程結(jié)束后學(xué)生對科學(xué)研究的認(rèn)知度仍然欠缺，理論聯(lián)系實際的能力不足，所以需要開展結(jié)論未知的綜合型探索性實驗，把食品微生物實驗課程各單項整體應(yīng)用起來，增強各單項之間的關(guān)聯(lián)性，設(shè)計貼近日常生活的實驗題目[1]。在保障本科生掌握微生物基本實驗技能的基礎(chǔ)上，幫助學(xué)生從學(xué)習(xí)單項實驗操作，發(fā)展為從文獻檢索和實驗設(shè)計到團結(jié)協(xié)作完成實驗。從而不斷提高本科生的實驗技能和提升對實驗整體性和系統(tǒng)性的宏觀認(rèn)知，激發(fā)本科生實驗興趣，以培養(yǎng)出既具有扎實理論基礎(chǔ)，又有較高實驗技能和實驗創(chuàng)新能力的食品領(lǐng)域工作者[2-3]。

目前，益生菌已廣泛用于乳制品行業(yè)[4-5]。該文從實驗教學(xué)內(nèi)容選擇、教學(xué)過程管理和完善考核制度等方面探討和總結(jié)探索性實驗項目在食品微生物學(xué)本科實驗課上的應(yīng)用，為食品微生物學(xué)實驗教學(xué)體系更新提供一些思路，供同類課程交流和探討。

1 發(fā)酵奶制品中益生菌檢測實驗

1.1實驗?zāi)康?/h3>

掌握滅菌、梯度稀釋和不同食品中微生物的測定、分離、接種、培養(yǎng)及菌落計數(shù)等操作。完成市售發(fā)酵飲料產(chǎn)品中乳酸菌的檢測，對市售發(fā)酵奶制品中乳酸菌的活菌含量有所了解。

1.2儀器與試劑

材料：供試發(fā)酵奶制品，市售益生菌飲料均可。

儀器：滅菌鍋、恒溫振蕩搖床、培養(yǎng)箱、天平、均質(zhì)器、恒溫水浴箱、移液槍及配套槍頭、500 mL錐形瓶、培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器、放大鏡、具塞試管和接種環(huán)等。

1.3實驗步驟及內(nèi)容設(shè)計

1.3.1樣品稀釋

(1)在超凈工作臺內(nèi)，以無菌移液器移取25 mL樣品置于已滅菌的盛有225 mL生理鹽水的錐形瓶中(瓶內(nèi)預(yù)裝一定數(shù)目的無菌玻珠)，搖勻，得到1∶10的樣品稀釋勻液。

(2)用移液器移取1 mL已稀釋成1∶10的樣品勻液，沿管壁緩緩注入已滅菌的盛有9 mL稀釋液的試管中(注意吸頭尖端避免觸及液面)，搖勻，得到1∶100的樣品稀釋勻液。

(3)依照以上操作步驟，制備一系列10倍梯度的稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次均更換無菌吸頭。

1.3.2乳酸菌總數(shù)測定

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是可發(fā)酵利用糖類，并產(chǎn)生大量乳酸的一類細菌的通稱。國標(biāo)中檢測的乳酸菌主要有雙歧桿菌 (Bifidobacterium) 、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus) 和乳桿菌 (Lactobacillus)。

(1)雙歧桿菌的計數(shù)。依據(jù)對待檢樣品中雙歧桿菌可能含量的估計，選擇連續(xù)的3個稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。在36 ℃下厭氧培養(yǎng)72 h后，對平板上的所有菌落進行計數(shù)。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內(nèi)完成。

(2)嗜熱鏈球菌的計數(shù)。依據(jù)對待檢樣品中嗜熱鏈球菌可能含量的估計，選擇連續(xù)的3個稀釋度，分別吸取每一個稀釋度的樣品勻液1 mL置已于滅菌的平皿內(nèi)，每一個稀釋度均做2個平皿做為平行。先將稀釋液加入平皿，再將已冷卻至48 ℃的MC培養(yǎng)基約15 mL傾注進平皿內(nèi)，平行轉(zhuǎn)動平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻。在36 ℃下需氧培養(yǎng)72 h后計數(shù)。在MC瓊脂平板上，嗜熱鏈球菌的菌落特征是菌落為中等偏小的紅色菌落，邊緣整齊光滑，直徑(2± 1 mm)，菌落背面呈現(xiàn)粉紅色。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內(nèi)完成。

(3)乳桿菌的計數(shù)。依據(jù)對待檢樣品中乳桿菌可能含量的估計，選擇連續(xù)的3個稀釋度，分別吸取每一個稀釋度的樣品勻液1 mL置已于滅菌的平皿內(nèi)，每一個稀釋度均做2個平皿做為平行。先將稀釋液加入平皿，再將已冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基約15 mL傾注進平皿內(nèi)，平行轉(zhuǎn)動平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻。(36 ± 1)℃厭氧培養(yǎng)(72 ± 2)h。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內(nèi)完成[6]。

1.4實驗結(jié)果

菌落計數(shù)以菌落形成單位(CFU)表示，可用肉眼或放大鏡觀察，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。

選取菌落數(shù)為30～300 CFU且菌落無蔓延生長的平板用于菌落總數(shù)計數(shù)。<30 CFU的平板可計算具體菌落個數(shù)，>300 CFU的平板可記錄成“多不可計”。每一個稀釋度的菌落總數(shù)需選取2個平板計數(shù)結(jié)果的平均值，再將此平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)待測樣品中菌落總數(shù)。如圖1所示，2個平板稀釋倍數(shù)均為10-7，則市售乳飲料中干酪乳桿菌的數(shù)量為1.3×109CFUmL。

如果連續(xù)2個稀釋度的平板上菌落總量在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，按式(1)計算。

(1)

式中N——待測樣品中菌落總數(shù)

∑C——含適宜范圍菌落數(shù)平板上的菌落數(shù)總和

n1——低稀釋倍數(shù)的平板個數(shù)

n2——高稀釋倍數(shù)的平板個數(shù)

d——稀釋因子即低稀釋倍數(shù)的稀釋度

圖2為市售飲料中嗜熱鏈球菌平板計數(shù)實例，其中，平皿A稀釋倍數(shù)10-5，平皿B稀釋倍數(shù)10-6，則該市售飲料中嗜熱鏈球菌數(shù)量為2.8×107CFUmL。

2 實驗實施過程及時間安排

該綜合型探索性實驗過程分為3個階段。

第1階段：課前開展討論并確定實驗方案。教師在開始授課前2周布置實驗項目，將項目名稱、實驗?zāi)康暮鸵饬x、注意事項等發(fā)給學(xué)生。學(xué)生2人為一組，要求每個學(xué)生都要通過各種途徑查閱文獻資料，自行進行分析討論，結(jié)合文獻資料和已學(xué)過的實驗操作初步確定實驗方案，課前1周由教師組織課堂討論，教師按照實驗的可行性和準(zhǔn)確性等要求對方案進行審查，并指出方案中存在的問題，學(xué)生進一步修訂方案，教師課前檢查并確定實驗最終方案[7]。

第2階段：實驗實施過程。各小組根據(jù)已確定的實驗方案，在現(xiàn)有實驗室條件下開展實驗。小組學(xué)生在實驗過程中需相互合作，遇到困難時，小組學(xué)生先進行討論并提出解決辦法，再尋求教師幫助。在整個實驗過程中，約3名教師隨堂巡視，每位教師負(fù)責(zé)學(xué)生8～12人，規(guī)范學(xué)生的實驗操作手法，避免或減少因?qū)嶒灢僮鞑划?dāng)而造成的人為誤差，以提高實驗結(jié)果的可靠性[8]。

第3階段：實驗結(jié)果總結(jié)與分析。實驗完成后，學(xué)生觀察實驗結(jié)果，分析實驗結(jié)果是否達到預(yù)期，并分析整個實驗過程，總結(jié)經(jīng)驗教訓(xùn)，分析成敗關(guān)鍵環(huán)節(jié)及實驗操作要點，完成實驗報告，教師按照對應(yīng)的考核評價標(biāo)準(zhǔn)給出分?jǐn)?shù)。

3 考核評價標(biāo)準(zhǔn)

實驗課總成績?yōu)?00分，成績組成和比例與傳統(tǒng)驗證性實驗項目不同，進行了重新規(guī)劃。其中，學(xué)習(xí)態(tài)度及團隊合作占20%，實驗操作占40%，實驗報告占40%。學(xué)習(xí)態(tài)度及團隊合作主要考察學(xué)生主動性、遵守微生物學(xué)實驗室守則、按時提交預(yù)習(xí)報告和實驗方案及實驗過程中積極配合和團結(jié)協(xié)助情況。實驗操作主要考察學(xué)生微生物學(xué)的基本操作技能，以及有關(guān)儀器設(shè)備的正確使用，由教師根據(jù)操作情況給予課堂評分[9-10]。實驗報告內(nèi)容及分值進一步細化到實驗?zāi)康摹嶒炘砀攀?、材料和儀器、實驗內(nèi)容及步驟、結(jié)果分析與討論和思考題，其中，結(jié)果分析及思考題部分的分值占實驗報告的50%。此評價方式更注重過程管理和側(cè)重實驗結(jié)果分析與學(xué)生的討論思考環(huán)節(jié)，督促學(xué)生關(guān)注課前討論、課上操作和課后分析的全過程。探索性實驗課程的實施培養(yǎng)了學(xué)生的團隊協(xié)作精神，訓(xùn)練學(xué)生設(shè)計、歸納并總結(jié)，提倡討論與思考，學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析并解決問題的能力在此過程中得到較好的鍛煉。

4 結(jié)束語

“發(fā)酵奶制品中益生菌的檢測”實驗項目所需時間不長且儀器設(shè)備簡單，在本科實驗教學(xué)中可以實現(xiàn)。該實驗項目緊跟生活熱點，在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，學(xué)生非常感興趣。通過把綜合型探索性實驗項目引入食品微生物學(xué)實驗課，把傳統(tǒng)的“以課程為中心”實驗教學(xué)內(nèi)容轉(zhuǎn)移到“以問題為中心”的軌道上，學(xué)生通過探索性實驗可以將理論課所學(xué)的知識點和實驗課的操作單元有機結(jié)合，知識掌握更加深入和系統(tǒng)，鍛煉本科生查閱文獻和運用已掌握的食品微生物學(xué)基礎(chǔ)知識及實操技能來解決生產(chǎn)實際問題的能力，使其能在未來的職業(yè)生涯中盡快適應(yīng)社會。