BRWD3對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

張競(jìng)堯，李春曉，王婷，南鵬，王勁松，周彥彤，孫芳洲，張柏林，馬飛，王海娟，錢海利

國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤[1]，其病死率位居全球女性癌癥病死率第1位(15.0%)，是女性癌癥死亡的首要原因[2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，甚至部分乳腺癌在原發(fā)灶很小的階段就已發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而失去了早期治愈的機(jī)會(huì)。因此，深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，可為乳腺癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新策略。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多層面、多步驟以及受多種生長(zhǎng)因子調(diào)控的序貫性復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程[3-4]，主要包括腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵入脈管、微環(huán)境內(nèi)克隆生成等環(huán)節(jié)[5]。本研究探討溴結(jié)構(gòu)域和WD重復(fù)蛋白3(bromodomain and WD repeat domain containing 3，BRWD3)對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自天津百若克醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；BRWD3抗體購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司；ERK1/2抗體、磷酸化ERK1/2抗體、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；Bradford試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG、抗兔IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；T4多聚核苷酸激酶BsmB Ⅰ限制性內(nèi)切酶、快速連接酶均購(gòu)自美國(guó)NEB公司；ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；lentiGuide-Puro質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；293TN細(xì)胞、MDA-MB-231-cas9細(xì)胞、大腸埃希菌stbl3化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞以及pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231-cas9細(xì)胞用含10%胎牛血清、0.1 mg鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)敲除BRWD3

1.3.1sgRNA設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)張峰教授提供的全基因組敲除所需的sgRNA列表Library A[6]，選 擇B RW D 3 的3 條s g R N A 序 列(s g B RW D 3-1：

GCTACCCACCGGCTTCGATC；sgBRWD3-2：ACTGCAAGAACCTAGCGATC；sgBRWD3-3：AGCTGTATTACCTGATCGCT)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將lentiGuide-Puro質(zhì)粒在55 ℃下用BsmB Ⅰ酶切10 min后進(jìn)行膠回收，用T4多聚核苷酸激酶將合成的sgRNA退火成雙鏈。反應(yīng)體系：1 μl上游引物(100 μmol/L)，1 μl下游引物(100 μmol/L)，1 μl 10×T4多聚核苷酸激酶緩沖液，6.5 μl ddH2O，0.5 μl T4多聚核苷酸激酶。PCR反應(yīng)程序：37 ℃，30 min；95 ℃，5 min；之后5 ℃/min降溫至25 ℃。用T4連接酶將酶切后的lentiGuide-Puro質(zhì)粒與雙鏈sgRNA相連。連接體系：酶切后的lentiGuide-Puro質(zhì)粒50 ng，1 μl雙鏈sgRNA(1:200稀釋)，5 μl 2×快速連接酶緩沖液，加ddH2O補(bǔ)至10 μl；然后向連接體系中加入1 μl快速連接酶，室溫連接10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，篩選于含氨芐抗性的LB平板，37 ℃細(xì)菌孵箱中孵育過(guò)夜，挑取3個(gè)單克隆進(jìn)行搖菌和鑒定。

1.3.3病毒包裝 以293TN細(xì)胞為載體，當(dāng)293TN細(xì)胞融合至50%時(shí)，利用Lipofectamin 2000將目的質(zhì)粒(3種sgRNA質(zhì)粒sgBRWD3-1、sgBRWD3-2和sgBRWD3-3)及病毒包裝骨架質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，48 h后收集上清，用0.45 μm濾器過(guò)濾，收集上清。

1.3.4病毒感染靶細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞篩選 接種MDA-MB-231-cas9細(xì)胞于小皿中，細(xì)胞融合至50%時(shí)分為對(duì)照組和BRWD3敲除組，分別加入空載質(zhì)粒lentiGuide-Puro病毒和sgBRWD3病毒，4 d后，加入6 μg/ml嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后將嘌呤霉素的濃度降至3 μg/ml維持。

1.3.5Western blotting進(jìn)行基因敲除效率檢測(cè)及機(jī)制驗(yàn)證 在嘌呤霉素壓力篩選下，細(xì)胞仍可穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting檢測(cè)BRWD3的敲除效率，以及敲除BRWD3對(duì)乳腺癌細(xì)胞ERKV2的磷酸化的影響。

1.4Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 于Transwell小室膜上鋪100 μl、4 ℃預(yù)冷的基質(zhì)膠(1:20，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋)，將鋪好的小室放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h以上以使基質(zhì)膠凝固在膜上，正常培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞混勻于含10%胎牛血清的DMEM中，下室加入含20%胎牛血清的DMEM。37 ℃培養(yǎng)24 h，用甲醇固定小室10 min，結(jié)晶紫染色10 min，將膜烘干、封片，病理掃片機(jī)掃片，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞，取平均值。

1.5實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 取生長(zhǎng)良好的MDA-MB-231細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，用PBS清洗，滴加胰酶消化至細(xì)胞可從皿底脫落，加入完全培養(yǎng)基終止消化并計(jì)數(shù)。在S16板中加入50 μl正常培養(yǎng)基測(cè)基線，之后加入100 μl細(xì)胞懸液(含5000個(gè)細(xì)胞)，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。

1.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 BALB/c裸鼠20只，雌性，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在SPF條件下于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院裸鼠室內(nèi)飼養(yǎng)。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

裸鼠淋巴轉(zhuǎn)移模型建立：將11只裸鼠分為對(duì)照組(n=5)和敲除組(n=6)，對(duì)照組裸鼠足墊注射MDA-MB-231細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞/只)，敲除組注射敲除BRWD3的細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞/只)。49 d后收集兩組裸鼠的腘窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)，觀察淋巴結(jié)的體積，并對(duì)淋巴結(jié)行HE染色觀察。

裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型建立：將9只裸鼠分為對(duì)照組(n=5)和敲除組(n=4)，對(duì)照組裸鼠尾靜脈注射MDA-MB-231細(xì)胞懸液(7.7×105個(gè)細(xì)胞/只)，敲除組注射敲除BRWD3的細(xì)胞懸液(7.7×105個(gè)細(xì)胞/只)。48 d后收集兩組裸鼠的肺臟，并計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。

1.7Western blotting檢測(cè)BRWD3、ERK1/2和p-ERK1/2的表達(dá) 提取敲除BRWD3的MDA-DB-231細(xì)胞和對(duì)照MDA-DB-231細(xì)胞的總蛋白，采用Bradford試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，混勻后95～100 ℃變性10 min，上樣。電泳條件：濃縮膠80 V，分離膠120 V。半干法轉(zhuǎn)膜(恒壓15 V，時(shí)間90 min)，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入BRWD3抗體(1:1000)、ERK1/2抗體(1:1000)、p-ERK1/2抗體(1:1000)及GAPDH抗體(1:5000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用PBST漂洗3次，5 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(1:5000)、抗鼠二抗(1:5000)，室溫孵育1 h，漂洗3次，5 min/次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.8公共數(shù)據(jù)分析 利用CCLE(cancer cell line encyclopedia, https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)[7]中乳腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析本實(shí)驗(yàn)室已有的乳腺癌細(xì)胞系的表達(dá)。利用cBioPortal中的TCGA(the cancer genome atlas)乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集檢索BRWD3的共表達(dá)基因，并利用DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)平臺(tái)對(duì)這些基因行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析，尋找BRWD3的相關(guān)生物學(xué)功能和相關(guān)通路。利用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING)分析篩選出的共同表達(dá)基因編碼蛋白間的相互作用關(guān)系。通過(guò)TCGA乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析BRWD3在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組的表達(dá)情況。同時(shí)利用KMPLOT(Kaplan-Meier plotter)探究BRWD3表達(dá)量與生存的關(guān)系，分析BRWD3基因表達(dá)高低與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BRWD3對(duì)乳腺癌細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響 CCLE乳腺癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)分析顯示，乳腺癌MDA-MB-231、HCC38細(xì)胞系的BRWD3 mRNA表達(dá)水平較高(圖1)。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BRWD3敲除組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.01，圖2)。

圖1 7種乳腺癌細(xì)胞系BRWD3 mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of BRWD3 mRNA in 7 breast cancer cell lines

圖2 BRWD3敲除組與對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞侵襲能力比較(n=3)Fig.2 Comparison of invasive ability of breast cancer cells between BRWD3 knockout group and control group (n=3)

圖3 BRWD3敲除組與對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞增殖能力比較(n=3)Fig.3 Comparison of proliferation ability of breast cancer cells between BRWD3 knockout group and control group (n=3)

2.2BRWD3對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖能力的影響 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示，BRWD3敲除組的細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組(P<0.01，圖3)。

2.3BRWD3對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的影響 HE染色結(jié)果顯示，兩組裸鼠均發(fā)生腘窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。與對(duì)照組比較，BRWD3敲除組裸鼠腘窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴體積明顯增大(P<0.05，圖4)。肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BRWD3敲除組裸鼠的肺結(jié)節(jié)數(shù)未明顯增多(圖5)。

2.4BRWD3共表達(dá)基因的GO與KEGG富集分析結(jié)果 通過(guò)cBioPortal分析TCGA乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集得到基因與BRWD3皮爾森相關(guān)系數(shù)(r)，取r>0.5的基因行DAVID聚類分析。GO功能分析結(jié)果顯示，BRWD3共表達(dá)基因主要富集于基因表達(dá)調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、染色體的組織和修飾、蛋白質(zhì)泛素化等生物學(xué)功能(圖6A)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，BRWD3共表達(dá)基因主要富集于氧化磷酸化、MAPK通路、蛋白質(zhì)泛素化等信號(hào)通路(圖6B)。利用STRING分析r>0.6的BRWD3共表達(dá)基因，結(jié)果顯示，BRWD3的互作基因集中在蛋白質(zhì)泛素化、RNA代謝等功能(圖6C)。

圖4 BRWD3對(duì)乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 Effect of BRWD3 on lymphatic metastasis of breast cancer

圖5 BRWD3對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Effect of BRWD3 on lung metastasis of breast cancer

2.5Western blotting水平驗(yàn)證結(jié)果 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞感染含BRWD3 sgRNA質(zhì)粒的慢病毒后，BRWD3蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MAPK信號(hào)通路的ERK1/2磷酸化水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，部分驗(yàn)證了ERK1/2信號(hào)通路是BRWD3的潛在調(diào)控通路(圖7)。

2.6BRWD3在乳腺癌患者中的表達(dá)及其與乳腺癌患者生存的關(guān)系 TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(228例患者，即N>0)BRWD3的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)移組(222例患者，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即N=0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8)。KMPLOT分析結(jié)果顯示，BRWD3高表達(dá)的乳腺癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival，RFS)顯著長(zhǎng)于低表達(dá)患者，且BRWD3低表達(dá)患者的預(yù)后較差(P<0.001，圖8)。

圖6 BRWD3共表達(dá)基因聚類分析及互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Clustering analysis and interactive network of BRWD3 co-expression genes

圖7 BRWD3對(duì)ERK1/2的磷酸化調(diào)控作用Fig.7 BRWD3 regulated phosphorylation of ERK1/2

3 討 論

本研究主要通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)以及乳腺癌公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BRWD3調(diào)控乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。BRWD3為BRDs家族成員之一。BRDs家族在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，與神經(jīng)[8]和炎癥性疾病[9]以及腫瘤[10]等有關(guān)，且該家族成員在腫瘤中異常表達(dá)。BRWD3在乳腺癌組織中表達(dá)異常，對(duì)TCGA乳腺癌轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析顯示，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BRWD3的表達(dá)水平低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。由此可見(jiàn)，對(duì)BRWD3的研究不僅可進(jìn)一步加深對(duì)BRDs家族的認(rèn)識(shí)，還有助于深入理解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

本研究體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BRWD3能夠抑制乳腺癌的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為了探究其作用機(jī)制，本研究進(jìn)行BRWD3共表達(dá)基因的GO功能、KEGG富集以及STRING互作蛋白的富集分析，發(fā)現(xiàn)其均富集于蛋白質(zhì)泛素化。蛋白質(zhì)泛素化是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。癌細(xì)胞中正常的泛素化功能被破壞，可引起腫瘤蛋白的累積或抑癌蛋白的降解增加，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[11]。BRWD3可能通過(guò)泛素化調(diào)控乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，繼而影響乳腺癌患者的生存。有研究發(fā)現(xiàn)，BRWD3位于人類染色體Xq21.1，其編碼的蛋白質(zhì)含有溴結(jié)構(gòu)域和WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域(WD40 repeat，WDR)，屬于BRDs家族[12]。BRDs家族可以選擇性地識(shí)別并結(jié)合乙酰化LYS殘基，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。該家族涉及進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，存在于多種具有催化和支架功能的蛋白質(zhì)中[10]。提示BRWD3通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化及蛋白互作發(fā)揮功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，BRWD3的共表達(dá)基因富集于氧化磷酸化及MAPK信號(hào)通路，敲除BRWD3能夠促進(jìn)MAPK信號(hào)通路的ERK1/2磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路在多種腫瘤(乳腺癌[13]、結(jié)腸癌[14]、黑色素瘤[15]等)中被激活。MAPK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)乳腺癌的血管生成以及轉(zhuǎn)移，其中ERK的活化可誘導(dǎo)MMP家族的表達(dá)上調(diào)以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解[16]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK信號(hào)通路的激活可抑制腫瘤生長(zhǎng)，如白藜蘆醇刺激可引起ERK1/2激活，進(jìn)而作用于其下游的凋亡相關(guān)分子p53，磷酸化的p53下調(diào)凋亡相關(guān)分子，最終引起caspase-3活化，導(dǎo)致凋亡，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。 另有研究在順鉑刺激下發(fā)現(xiàn)了ERK活化介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[18]。本研究結(jié)果表明，BRWD3在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮雙重作用，即促進(jìn)增殖的同時(shí)能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這一現(xiàn)象是否與MAPK信號(hào)通路的雙重作用有關(guān)，亟待更深層次的研究。

圖8 BRWD3在乳腺癌患者中的表達(dá)及其與乳腺癌患者生存的關(guān)系Fig.8 Expression of BRWD3 in breast cancer patients and its relationship with survival of the patients

BRWD3具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的雙重作用，提示BRWD3在乳腺癌的惡性進(jìn)展中所發(fā)揮的作用是復(fù)雜的。BRDs家族成員在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮多樣化的作用，如BRD4在腫瘤中高表達(dá)，導(dǎo)致MYC和NF-κB信號(hào)激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]，而B(niǎo)RD7在乳腺癌中可通過(guò)與p53相互作用發(fā)揮抑癌功能[20]，由此可見(jiàn)，BRDs家族調(diào)控腫瘤進(jìn)展的作用錯(cuò)綜復(fù)雜，具體機(jī)制尚不明確。既往研究顯示，多種腫瘤相關(guān)因子在腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖中發(fā)揮雙重作用，如轉(zhuǎn)錄因子MAZ通過(guò)激活和抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在乳腺癌中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21]；原癌基因MYC促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移(包括肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移)[22]；FBXO22促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)可抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及肺轉(zhuǎn)移[23]等。BRWD3在腫瘤初期促進(jìn)其增殖形成原發(fā)灶，當(dāng)腫瘤進(jìn)展進(jìn)入侵襲轉(zhuǎn)移階段時(shí)，BRWD3被抑制(通路尚未明確)，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，BRWD3能夠明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與乳腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，其潛在的調(diào)控通路涉及蛋白質(zhì)泛素化、MAPK信號(hào)通路等，但其在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未明確。因此，未來(lái)仍需深入探究BRWD3調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，以為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)，同時(shí)為診斷和預(yù)后判斷提供新靶標(biāo)。