滋脾通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠的療效及作用機(jī)制

程亞偉，邱曉堂，丁一，吳小翠，張永杰

海南省中醫(yī)院治未病中心，?？?570203

在我國，糖尿病(diabetes mellitus，DM)是僅次于高血壓的第二大慢性疾病[1-2]，其慢性并發(fā)癥對患者的生活質(zhì)量造成極大影響。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM的常見并發(fā)癥，是終末期腎病的主要病因[3]。DN患者存在復(fù)雜的糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血液高凝狀態(tài)、腎臟毛細(xì)血管功能受損等問題[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DN歸屬于“消渴”“消癉”“水腫”“關(guān)格”等范疇，“從脾論治”是其主要的治療觀點之一[5]。滋脾通絡(luò)方主要成分為黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川牛膝等，有滋陰補(bǔ)氣、活血通絡(luò)的作用。據(jù)海南省中醫(yī)院治未病中心10余年的臨床應(yīng)用反饋，該方可改善DN患者的血糖水平及腎功能[6]。本研究使用滋脾通絡(luò)方治療DN模型大鼠，探究其治療DN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗儀器與試劑 H2050R-1型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；AL204型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；卓越金采血糖儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；SA-6000型全自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司)；BK-400型全自動生化分析儀(BIOBASE博科控股集團(tuán)有限公司)。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)、羧甲基纖維素鈉、枸櫞酸、枸櫞酸三鈉(杭州天動立化學(xué)品有限公司)，其余試劑均為分析純。

1.2實驗藥品 根據(jù)動物體表面積比率換算，每千克大鼠體重對應(yīng)藥量為：黃芪4.50 g，山藥1.80 g，當(dāng)歸1.80 g，赤芍1.35 g，懷牛膝1.80 g，生大黃0.45 g，鬼箭羽1.35 g，水蛭0.90 g，三七粉0.27 g。藥材由海南省中醫(yī)院制劑室制備并提供，制備方法：每次制備10份量，以水作溶劑煎煮提取兩次，第1次用水量為總藥材劑量的10倍，第2次為5倍，每次提取2.5 h，合并兩次提取藥液，濾布過濾后真空袋包裝冷凍儲存。

1.3實驗動物及分組 成年SPF級雄性SD大鼠30只，體重80～100 g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)20140001。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病腎病模型組(DN組)、滋脾通絡(luò)方干預(yù)組(DZ組)及正常對照組(O組)，每組10只。實驗過程符合國家及單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.4實驗方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，O組給予正常飼料飼養(yǎng)。DN組及DZ組大鼠給予高糖高脂飼料(熱量為4.43 kcal/g)喂養(yǎng)4周，然后按35 mg/kg腹腔注射1%STZ枸櫞酸緩沖液，夜間禁食喂養(yǎng)3 d后，每隔24 h自尾靜脈采血測空腹血糖值，連續(xù)3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L，視為造模成功。O組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。造模成功1周后，DZ組按體重給予對應(yīng)藥物灌胃，DN組及O組給予羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.5指標(biāo)檢測 造模成功后，觀察大鼠一般情況。在第1、2、4、6、8周，每周一稱量大鼠體重，測尾靜脈血糖。第8周周六將大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液，檢測尿蛋白含量。第9周周一麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，檢測血清生化指標(biāo)和血液流變學(xué)指標(biāo)。取左側(cè)腎臟，生理鹽水洗凈吸干后，稱量腎臟質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟重量/體重。取右側(cè)腎臟處理后制備HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變情況。

1.6指標(biāo)分析 通過大鼠一般情況、腎功能(腎臟指數(shù)及24 h尿蛋白)、腎臟病理、體重及血糖、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平對大鼠DN病情進(jìn)行綜合分析。通過血清生化指標(biāo)中的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，血液流變學(xué)指標(biāo)中的全血高、中、低切變率(300 /s、115 /s、1 /s)下的全血黏度(WBV)、血漿黏度(MPAs)、全血還原黏度(WBRV)對大鼠的脂代謝、血液流變學(xué)和瘀血阻絡(luò)證候進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況比較 O組大鼠一般情況正常。DN組及DZ組大鼠造模成功后體重降低，多飲多尿，反應(yīng)呆板，毛色晦暗，肢體末端顏色發(fā)暗。經(jīng)藥物干預(yù)后DZ組大鼠癥狀有所緩解。

2.2各組大鼠腎功能比較 與O組相比，DN組大鼠的腎臟指數(shù)及24 h尿蛋白水平升高；與DN組相比，DZ組大鼠的腎臟指數(shù)及24 h尿蛋白水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn) O組大鼠腎臟組織正常；DN組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞增生明顯；DZ組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，細(xì)胞增生好轉(zhuǎn)，腎小管水腫減輕(圖1)。

表1 滋脾通絡(luò)方對各組大鼠腎功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

表1 滋脾通絡(luò)方對各組大鼠腎功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

圖1 各組大鼠光鏡下腎臟組織病理變化(HE ×400)Fig.1 Light microscopic pathology of renal in three groups of rats (HE ×400)

2.4各組大鼠體重及血糖水平比較 造模成功后，DN組及DZ組大鼠體重低于O組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。DN組大鼠體重自造模成功后逐漸下降，而DZ組大鼠在滋脾通絡(luò)方治療后體重逐漸上升，第4、6、8周時，DZ組體重明顯高于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。造模成功后，DN組及DZ組大鼠血糖水平明顯高于O組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。采用滋脾通絡(luò)方治療后，DZ組血糖水平逐漸下降，第4、6、8周時，DZ組血糖水平明顯低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表3)。

2.5各組大鼠的血清生化指標(biāo)比較 DN組及DZ組的Scr、BUN、TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于O組，DZ組的BUN、TC、TG、LDL-C均低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DZ組及DN組的Scr及HDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

2.6各組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)比較 DN組及DZ組大鼠的WBV、MPAs及WBRV均明顯高于O組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DN組相比，DZ組大鼠的WBV、MPAs及WBRV均有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表5)。

表2 各組大鼠體重比較(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

表2 各組大鼠體重比較(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O組 359.00±10.75 382.00±11.60 438.40±22.55 469.00±18.77 523.80±18.40 DN組 321.80±11.17(1) 318.00±6.67(1) 316.20±11.95(1) 307.60±11.17(1) 306.60±8.32(1)DZ組 319.60±17.81(1) 327.80±14.17(1) 339.80±15.83(1)(2) 350.80±10.21(1)(2) 353.40±10.64(1)(2)F 13.18 46.94 69.90 180.08 375.99 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表3 各組大鼠血糖水平比較(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

表3 各組大鼠血糖水平比較(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.01；與DN組比較，(2)P<0.01。

組別 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O組 4.80±0.89 4.86±0.71 4.90±1.07 4.82±0.38 4.46±0.43 DN組 21.18±1.10(1) 20.70±2.03(1) 20.28±1.51(1) 23.26±5.41(1) 20.40±1.72(1)DZ組 20.50±1.60(1) 20.26±1.54(1) 18.24±1.14(1)(2) 16.68±1.90(1)(2) 16.22±2.55(1)(2)F 174.97 222.93 39.65 106.28 48.22 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表4 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

表4 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

Scr. 血肌酐；BUN. 尿素氮；TC. 總膽固醇；TG. 三酰甘油；LDL-C. 低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C. 高密度脂蛋白膽固醇；與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)O組 68.54±2.32 5.90±0.46 1.38±0.18 0.29±0.05 1.08±0.24 0.32±0.11 DN組 122.80±5.36(1) 31.42±4.07(1) 8.76±0.74(1) 2.71±0.14(1) 3.14±0.19(1) 1.78±0.29(1)DZ組 120.24±4.35(1) 25.92±3.67(1)(2) 7.26±0.44(1)(2) 1.80±0.09(1)(2) 2.36±0.30(1)(2) 1.76±0.15(1)F 596.21 201.46 664.29 158.40 199.50 202.19 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表5 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

表5 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

WBV. 全血黏度；MPAs. 血漿黏度；WBRV. 全血還原黏度；與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 WBV MPAs WBRV高切 中切 低切O組 2.58±0.07 3.19±0.11 0.62±0.07 9.72±0.11 1.42±0.12 DN組 5.32±0.17(1) 6.02±0.14(1) 1.72±0.16(1) 16.27±0.31(1) 3.17±0.08(1)DZ組 2.91±0.12(1)(2) 3.45±0.09(1)(2) 0.79±0.08(1)(2) 10.07±0.19(1)(2) 1.52±0.06(1)(2)F 27.62 69.27 70.92 23.47 58.91 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 討 論

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟公布的最新數(shù)據(jù)，2019年全球約4.63億成人患DM，預(yù)計到2045年，DM患者可能達(dá)到7億，其中90%為2型DM[7]。DM并發(fā)癥已成為嚴(yán)重的公眾健康問題，其主要發(fā)生原因為微血管病變，而血液流變學(xué)改變和高血糖導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致微血管病變的關(guān)鍵因素，在DN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8-9]。因此，控制血糖、降低血液黏度是DN治療的關(guān)鍵。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)將DN歸屬于“消渴”“消癉”等范圍，基本病機(jī)為氣陰兩虛、燥熱內(nèi)生[10]，同時認(rèn)為血脂、血流變等指標(biāo)變化反映了DN的瘀血阻絡(luò)證候[11]。基于此，本研究選用滋脾通絡(luò)方對DN大鼠進(jìn)行治療，其中黃芪、山藥共為君藥，黃芪甘溫，補(bǔ)脾胃之氣，山藥甘平，補(bǔ)氣養(yǎng)陰；當(dāng)歸、赤芍、川牛膝共為臣藥，三種藥物起到養(yǎng)血活血，抑制血小板聚集的作用；大黃、鬼箭羽、三七共為佐使，起到破瘀通絡(luò)的作用[6]。

此前的大部分現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，黃芪及當(dāng)歸對D N 的治療作用是通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路，改善腎間質(zhì)纖維化達(dá)成的。另外，黃芪及當(dāng)歸還具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等功能[12-13]，山藥多糖也具有降低血糖、血脂的作用[14]。本研究結(jié)果提示，滋脾通絡(luò)方可明顯降低DN大鼠的血液黏度、血脂及血糖水平，改善大鼠腎臟病理情況。其治療DN的機(jī)制可能是通過改善大鼠的血液流變學(xué)及脂代謝，起到改善腎臟功能、降低血糖水平的作用。具體機(jī)制可能是滋脾通絡(luò)方對血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)具有拮抗作用。TXA2是一種具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮及血小板聚集作用的活性物質(zhì)，在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。黃芪中的毛蕊異黃酮在中低劑量情況下可抑制TXA2的合成[15]，當(dāng)歸中的有效成分阿魏酸也可以選擇性抑制TXA2合成酶活性，從而減少TXA2合成，抑制血小板聚集。

綜上所述，滋脾通絡(luò)方可通過改善血液流變學(xué)及脂代謝，發(fā)揮改善微循環(huán)、降低血糖水平、保護(hù)腎臟功能的作用。