凝膠滲透色譜聯(lián)用多角度激光光散射測定鐵皮石斛多糖分子量及其分布

胡衛(wèi)珍，齊振宇，陳曉芳，張嫻

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛作為我國名貴中藥，列中華九大仙草之首，具有滋養(yǎng)陰津、清熱生津、益智安神、強(qiáng)精壯骨之功效[1]。鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用[2-3]。對于多糖類產(chǎn)品，分子質(zhì)量是研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)，更是考察其質(zhì)量是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)之一，而且不同分子質(zhì)量的多糖，活性差異也較大，因此，測定多糖的分子質(zhì)量具有重要意義。

凝膠滲透色譜-多角度激光散射是用于測定聚合物、多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子絕對分子質(zhì)量的新技術(shù)，無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正，可同時獲得樣品分子質(zhì)量分布和樣品構(gòu)象信息。它以快速、高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦納入多糖質(zhì)控體系[4-5]，但目前用此項(xiàng)技術(shù)測定鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量及其分布的研究報道較少。本文以自制的鐵皮石斛多糖為研究對象，建立了凝膠滲透色譜-多角度激光光散射聯(lián)用技術(shù)測定鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量及其分布的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀(安捷倫科技公司)，DAWN HELEOS II多角度激光光散射儀、Optilab rEX示差、DynaPro NanoStar 動態(tài)激光光散射儀(美國懷雅特公司)，超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)，AUW220D電子天平(日本島津)，DK-8D電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，凝膠柱Shodex OHpak SB-806 HQ, Shodex OHpak SB-805 HQ(日本昭和電工株式會社)。實(shí)驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室制備的不同種源地鐵皮石斛凍干多糖樣品(分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示)，其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

凝膠柱：Shodex OHpak SB-806 HQ、Shodex OHpak SB-805 HQ串聯(lián)；流動相：含0.02% NaN3的0.15 mol·L-1的氯化鈉溶液(0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣)；流速：0.5 mL·min-1；MALLS檢測儀，RID檢測儀，進(jìn)樣量25 μL，柱溫25 ℃[6-7]。

1.3 供試品溶液制備

精密稱取鐵皮石斛凍干多糖樣品，用流動相配成3 mg·mL-1的溶液，待樣品完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾。過濾后濾液用高效凝膠滲透色譜聯(lián)用多角度激光散射和示差折光儀(HPSEC-MALLS-RID)進(jìn)行分析，采用Astra6軟件收集和處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

采用不同濃度的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，濃度高的樣品容易造成凝膠柱和檢測器的污染；而且多糖分子質(zhì)量較大，一般溶解度較小，濃度過高，易溶解不完全，從而造成較大實(shí)驗(yàn)誤差。相對濃度低的樣品會在凝膠柱上得到完全的洗脫和分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇樣品的濃度為3 mg·mL-1。

比較流動相超聲脫氣處理前后的測定情況發(fā)現(xiàn)，流動相內(nèi)溶解的氧氣進(jìn)入流路后，一方面影響了流量的穩(wěn)定性，另一方面會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的峰，從而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。故本實(shí)驗(yàn)流動相需要超聲脫氣處理。

2.2 HPSEC-MALLS-RID分析

采用HPSEC-MALLS-RID聯(lián)用技術(shù)對供試的鐵皮石斛多糖樣品進(jìn)行測定，其色譜圖見圖1。從圖1可看出，鐵皮石斛多糖樣品在MALLS和示差檢測器上給出的色譜圖有明顯差異。兩者的出峰時間不一樣，出現(xiàn)明顯的延遲；激光信號只呈現(xiàn)一個窄分布的色譜峰，而示差信號還呈現(xiàn)2個小的色譜峰，主要是由于激光信號強(qiáng)弱與樣品濃度、相對分子質(zhì)量有直接關(guān)系，對于分子尺寸較小的樣品來說，如果濃度太低，散射光強(qiáng)度就較弱，與之對應(yīng)的激光信號也較弱。而示差折光檢測器的信號只與分子濃度有關(guān)，示差圖上后面的峰是由于樣品中的小分子聚糖造成的。所以絕對分子質(zhì)量測定需要來自激光光散射檢測器和示差折光檢測器的信號。從測定結(jié)果可知，鐵皮石斛多糖樣品的數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)為2.903×105u，峰位分子質(zhì)量(Mp)為3.406×105u，重均分子質(zhì)量(Mw)為3.741×105u，Z均分子質(zhì)量(Mz)為5.033×105u，多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.289，說明其均一性良好。

A—多角度激光光散射檢測；B—示差檢測。

2.3 不同種源地多糖分子質(zhì)量及其分布差異

將3個不同種源地的鐵皮石斛多糖樣品，按照1.3節(jié)方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件測定其分子質(zhì)量與分子質(zhì)量分布，采用Astra6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表1。不同種源地鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量及分布有差異，種源Ⅰ的鐵皮石斛多糖重均分子質(zhì)量(Mw)最大，為3.741×105u。多分散系數(shù)(Mw/Mn)反映高分子化合物的分子質(zhì)量分散水平。3個種源的鐵皮石斛多糖多分散系數(shù)介于1.289～1.502，均具有較窄的分子質(zhì)量分布，但種源Ⅰ多糖分子均一性相對較好。旋轉(zhuǎn)半徑反映該分子的松散程度，旋轉(zhuǎn)半徑越小說明樣品的形態(tài)越緊致。從表1可以看出，這3個種源的多糖樣品旋轉(zhuǎn)半徑相似，都在60 nm左右。但旋轉(zhuǎn)半徑與重均分子質(zhì)量的大小順序不一致，這是由于在鹽溶液中樣品分子形狀發(fā)生皺縮，引起分子大小降低造成的。

3 小結(jié)

HPSEC-MALLS是近年來國際通用的多糖分子質(zhì)量分析方法。本文采用凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯(lián)用技術(shù)對鐵皮石斛多糖的分子質(zhì)量進(jìn)行了測定，并對不同種源間多糖分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行了分析比較。結(jié)果表明，不同種源地鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量及分布有差異。HPSEC-MALLS在鐵皮石斛多糖組分分析中具有很好的應(yīng)用前景，可為鐵皮石斛種源優(yōu)選、質(zhì)量評價提供參考。