人工基質(zhì)上附著生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

鐘銘晨，彭路菊，趙靜巖，鄧歡歡，葛利云*，梅琨

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035； 2.浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

河流是陸地水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，相比自然河流，城市河流受長期人為的影響較大[1]，污染嚴(yán)重時(shí)則會(huì)制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展。新型生態(tài)護(hù)坡基質(zhì)通過搭配種植植物固定在河岸邊，具有生態(tài)美觀、經(jīng)濟(jì)適用、施工簡便等特點(diǎn)，對恢復(fù)河道的自凈能力及對微生態(tài)系統(tǒng)的形成具有促進(jìn)作用，應(yīng)用前景良好[2]。微生物在河流生態(tài)系統(tǒng)氮、磷的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的作用，因此，對城市河道基質(zhì)上微生物的研究具有重要的生物學(xué)意義，并為生態(tài)治理和環(huán)境保護(hù)提供應(yīng)用價(jià)值[3]。

由于校內(nèi)河道水流較緩，處于相對靜止的狀態(tài)，能創(chuàng)造一個(gè)相對穩(wěn)定的生境，為一些相關(guān)試驗(yàn)的開展提供了良好的野外條件。本研究擬以人工基質(zhì)上生物膜為研究對象，通過刮取基質(zhì)上的生物膜得到待測樣品，采樣高通量測序技術(shù)分析不同環(huán)境條件下微生物的群落結(jié)構(gòu)差異。高通量可以通過對16S rDNA、18S rDNA、ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測序[4]，16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域(V1～V9)。保守區(qū)在細(xì)菌中差異不大，高變區(qū)具有屬和種的特性。通過對某一段高變區(qū)序列(V4區(qū)或V3～V4區(qū))進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序[5]。不同的16S rDNA序列的相似性高于97%就可將其歸屬為一個(gè)操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，每個(gè)OTU近似對應(yīng)于物種水平[6]。以16S rDNA擴(kuò)增進(jìn)行測序分析主要用于微生物群落多樣性和構(gòu)成的分析，大大拓展了對環(huán)境微生物的微生態(tài)認(rèn)知。通過研究2種不同環(huán)境下護(hù)岸基質(zhì)上的微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，確定了優(yōu)勢類群，可為河道特定功能菌群的進(jìn)一步研究和環(huán)境對微生物的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的材料為聚氯乙烯或聚丙烯經(jīng)亂絲熱熔相互搭接，再經(jīng)模具擠壓成型的三維網(wǎng)狀基質(zhì)。

1.2 樣品采集

采樣區(qū)域位于溫州醫(yī)科大學(xué)茶山校區(qū)一段河道內(nèi)，根據(jù)采樣點(diǎn)的布設(shè)，分別從種植植物的基質(zhì)上(A)和未種植植物的基質(zhì)上(B)刮取生物膜樣品，樣品在每個(gè)基質(zhì)距水面20和50 cm處刮取。樣品采集時(shí)間為2018年5月18日，用已滅菌的刀片和刷子刮取生物膜，置于已滅菌的2 mL的離心管中，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室中，于-80 ℃保存待測定。

1.3 高通量測序分析

樣品委托上海祥音生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行高通量測序。通過Barcode區(qū)分樣品序列，并對各樣本序列做質(zhì)量控制，去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體。在97%的相似性水平下，基于OTU聚類，即獲得各OTU的物種分類信息，基于此對每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類和匯總，得出豐度數(shù)據(jù)表，再根據(jù)Chao1豐富度估計(jì)量，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，進(jìn)而判斷生物群落的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。數(shù)據(jù)整理采用Excel 2016，使用Origin 8.1軟件進(jìn)行繪圖處理。進(jìn)行各樣本多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)及種群相對豐度差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性

Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，包括observed species、Chao1，Shannon及Simpson指數(shù)等。其中，OTU數(shù)為A50：12 143，A20：8 681，B50：11 919，B20：14 458。各樣品的OTU數(shù)存在較大差異，其中B20的OTU數(shù)量最高。通過observed_species和Chao1指數(shù)可以估計(jì)富集樣品的群落豐度，通過Shannon和Simpson指數(shù)可以估計(jì)樣品的群落多樣性。由表1可知，4個(gè)位點(diǎn)樣品的群落多樣性比較相近，而群落豐度上差異較大。

表1 不同位點(diǎn)纖維基質(zhì)上物種的α多樣性指數(shù)

2.2 群落組成

各采樣點(diǎn)樣品中所含的微生物涉及21個(gè)門21個(gè)綱，并存在不少OTU歸為Unclassified。各樣品優(yōu)勢門水平(相對豐度超過1%)的菌群組成情況見圖1。

圖1 不同位點(diǎn)基質(zhì)上的物種在門水平上群落結(jié)構(gòu)和分布

由圖1可知，取相對豐度高于0.1%的物種作為優(yōu)勢物種，其中變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)在各位點(diǎn)中所占比例最為明顯，為樣品中的優(yōu)勢門，其中變形菌門具有最高的相對豐度，在A區(qū)的變形菌門的相對豐度達(dá)到39.3%左右，B區(qū)變形菌門相對豐度較A處低，大致在30.5%。

在纖維基質(zhì)上，不同試驗(yàn)位點(diǎn)存在顯著差異。在深層和淺層的纖維基質(zhì)上附著的變形菌門(Proteobacteria)在2個(gè)采樣點(diǎn)變化趨勢基本一致，其中在A區(qū)，纖維基質(zhì)上的變形菌門(Proteobacteria)大于B區(qū)，說明植物的搭配種植，提高了變形菌門(Proteobacteria)的生存環(huán)境，提高了其豐度。說明變形菌門(Proteobacteria)可能依賴于植物生長提供的環(huán)境，或者說有植物的基質(zhì)能有利于變形菌門(Proteobacteria)的生長。

在纖維基質(zhì)上不同試驗(yàn)位點(diǎn)上存在顯著差異，在深層和淺層的纖維基質(zhì)上附著的變形菌門在2個(gè)采樣點(diǎn)變化趨勢基本一致，其中在A區(qū)，纖維基質(zhì)上的變形菌門大于B區(qū)，說明植物的搭配種植，提高了變形菌門的生存環(huán)境，提高了其豐度。說明變形菌門可能依賴于植物生長提供的環(huán)境，或者說有植物的基質(zhì)能有利于變形菌門的生長。

根據(jù)表2，在A、B區(qū)，不同采樣深度也存在明顯差異，A20樣品中變形菌門、浮霉菌門豐度分別是42.5%和17.7%，均高于A50的豐度值。每個(gè)點(diǎn)的樣品微生物群落組成在其他門水平上也存在較大差異。擬桿菌門A區(qū)的相對豐度均低于B區(qū)，同時(shí)B50采樣點(diǎn)的豐度大于B20。

表2 不同位點(diǎn)纖維基質(zhì)上優(yōu)勢物種的分布比例

3 小結(jié)

Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品的物種多樣性，包括observed species、Chao1，Shannon及Simpson指數(shù)等。樣品不同的Alpha多樣性指數(shù)的數(shù)值中，observed species和Chao1指數(shù)反映了樣品中群落的豐度，即單指群落中物種數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況[7]。Shannon及Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。在物種豐富度相同的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。Shannon和Simpson指數(shù)值越大，說明個(gè)體分配越均勻。若每一個(gè)體都屬于不同的種，Shannon和Simpson指數(shù)就大；若每一個(gè)體都屬于同一種，則Shannon和Simpson指數(shù)就小[7]。

在纖維基質(zhì)上，A50處的Chaol和observed species指數(shù)略高于B50，Shannon和Simpson指數(shù)也均呈相同趨勢，說明種植植物區(qū)樣品的群落的豐度和多樣性高于無植物區(qū)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在兩處試驗(yàn)點(diǎn)50 cm的Shannon和Simpson指數(shù)均大于20 cm處指數(shù)，說明在50 cm處物種多樣性相對較高。

物種豐度的分析是對每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類。結(jié)果表明，變形菌門、浮霉菌門在每個(gè)樣品中均占有絕對優(yōu)勢，且這2種優(yōu)勢種總的比例在種植植物區(qū)整體略高于無植物區(qū)，而擬桿菌門和綠彎菌門在植物區(qū)均是A50>A20，在無植物區(qū)沒有明顯差異。