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    浙南壇紫菜實(shí)驗(yàn)品系與傳統(tǒng)品系遺傳多樣性的AFLP分析

    2020-06-28 08:06:48劉穎張鵬王鐵桿任鵬
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異多態(tài)紫菜

    劉穎,張鵬,王鐵桿*,任鵬

    (1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,浙江 溫州 325005; 2.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 溫州 325005)

    壇紫菜(Pyropiahaitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta),紅藻綱(Rhodophyceae),紅毛菜目(Bangiales),紅毛菜科(Bangiaceae),法紫菜屬(Pyropia)[1]。主要棲息在潮間帶,是我國(guó)特有暖溫帶性種類,分布于浙江、福建和廣東三省沿海[2],其產(chǎn)量約占全國(guó)紫菜總產(chǎn)量的75%[3]。浙江壇紫菜產(chǎn)業(yè)位居全國(guó)第二,壇紫菜是浙江省第一大經(jīng)濟(jì)海藻,栽培面積6 667 hm2,養(yǎng)殖品種主要以原有的野生型為主。近年來(lái)氣候變化明顯加劇,本地養(yǎng)殖品系連續(xù)發(fā)生嚴(yán)重病爛,養(yǎng)殖減產(chǎn),所以推廣具有優(yōu)良性狀的新品系對(duì)壇紫菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。然而對(duì)于篩選推廣的新品系的遺傳多樣性水平及其與傳統(tǒng)的本地養(yǎng)殖品系壇紫菜的遺傳多樣性差異尚不清楚。遺傳多樣性是生物對(duì)復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)能力的一種反應(yīng)[4],是評(píng)價(jià)生物資源狀況的重要依據(jù)。因此,對(duì)壇紫菜新品系遺傳多樣性水平的研究具有重要意義。

    擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)是迄今最有效的分子標(biāo)記之一,已被大量運(yùn)用在大型海藻的種質(zhì)鑒定[5-6]、遺傳多樣性分析[7-8]、連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[9],因此,本研究選用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同品系的壇紫菜進(jìn)行遺傳多樣性分析,以了解其遺傳多樣性和遺傳特征等信息,為壇紫菜種質(zhì)資源的遺傳背景信息積累提供參考[10]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本實(shí)驗(yàn)所用壇紫菜樣品浙南3號(hào)和玉環(huán)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖種于2017年11月8日隨機(jī)采自浙江省臺(tái)州市玉環(huán)市箬笠礁海域中的養(yǎng)殖網(wǎng)簾,各取30株用于AFLP分析。

    1.2 基因組DNA的提取

    使用“DN14-植物基因組DNA快速提取試劑盒”(北京艾德萊生物科技有限公司,DN1401)按照操作說(shuō)明提取壇紫菜基因組DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后,利用微量分光光度計(jì)(Nano-400)測(cè)定DNA的質(zhì)量與濃度,將DNA濃度調(diào)至20 ng·μL-1,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 AFLP分析

    用于AFLP分析的內(nèi)切酶(EcoRⅠ和MseⅠ)和T4 DNA連接酶為Fermentas公司生產(chǎn);實(shí)驗(yàn)所用的接頭和引物由英濰捷基(上海)公司合成,序列見表1。毛細(xì)管電泳檢測(cè)由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。反應(yīng)步驟和反應(yīng)體系如下:

    表1 AFLP引物與接頭序列

    酶切體系:模板DNA(20 ng·μL-1)5 μL,EcoRⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL,MseⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL,10×Tango Buffer 4 μL,滅菌純凈水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件:37 ℃酶切4 h,接著65 ℃酶切4 h,80 ℃滅活20 min。

    連接體系:酶切產(chǎn)物5 μL,T4連接酶0.5 μL,10×T4 Buffer 1 μL,50% PEG4000 1 μL,EcoRⅠ接頭(5 μmol·L-1)0.5 μL,MseⅠ接頭(50 μmol·L-1)0.5 μL,滅菌純凈水補(bǔ)齊至10 μL,22 ℃連接1 h,70 ℃滅活5 min。

    預(yù)擴(kuò)增:連接產(chǎn)物1 μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL,10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL,EcoRⅠ preamp primer(10 μmol·L-1)0.5 μL,MseⅠ preamp primer(10 μmol·L-1)0.5 μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;進(jìn)行20個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s);72 ℃延伸10 min。

    選擇擴(kuò)增:將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液2 μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL,10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL,EcoRⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL,MseⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;以每個(gè)循環(huán)降1 ℃的梯度從65 ℃退火到56 ℃退火(94 ℃變性30 s,65 ℃~56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s);然后進(jìn)行27個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s);72 ℃延伸10 min。

    選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems, USA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型,用GeneMapper Software 5進(jìn)行等位基因大小分析。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果選取片段大小在0~500 bp的片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì),構(gòu)建“0、1”矩陣,運(yùn)用PopGen 3.2軟件計(jì)算種群內(nèi)部的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)以及Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)、種群總遺傳變異(Ht)、種群內(nèi)遺傳變異(Hs)、種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、種群間基因流動(dòng)系數(shù)(Nm)。用AFLP data analyzer[11]計(jì)算各群體間的相似系數(shù)和遺傳距離,根據(jù)遺傳距離,采用MEGA 7.0分析2個(gè)品系之間的聚類關(guān)系,構(gòu)建UPGMA和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AFLP擴(kuò)增多態(tài)性

    用16對(duì)引物組合對(duì)壇紫菜樣品進(jìn)行擴(kuò)增,共篩選出以下8對(duì)多態(tài)性好的引物組合:E-AAC/M-CAG、E-AAC/M-CTC、E-AAC/M-CTG、E-AAG/M-CAG、E-AAG/M-CTC、E-AAG/M-CTG、E-AGG/M-CAA、E-ACC/M-CTG。用篩選出的8對(duì)引物對(duì)2個(gè)群體ZN3(n=30)和YH(n=30)進(jìn)行AFLP分析(圖1),共得到964個(gè)有效位點(diǎn)。每對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)在53~181個(gè),平均每對(duì)引物擴(kuò)增出120.5個(gè)AFLP位點(diǎn)。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物對(duì)是E-AAG/M-CTC。每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)比例均大于97%(表2)。

    圖1 壇紫菜部分AFLP選擇性擴(kuò)增結(jié)果

    表2 AFLP選擇性引物的擴(kuò)增結(jié)果

    2.2 遺傳多樣性

    遺傳多樣性是生物對(duì)復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)能力的一種反應(yīng),是評(píng)價(jià)生物資源狀況的重要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中8對(duì)引物在ZN3和YH群體中檢出多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及比例(PPL)分別是665個(gè)(69.0%)和786個(gè)(81.5%),其中ZN3的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)低于YH群體,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)也低于YH群體(表3),因此,認(rèn)為YH本地壇紫菜具有較高的遺傳多樣性。

    表3 2個(gè)壇紫菜品系的遺傳多樣性參數(shù)

    2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

    2個(gè)壇紫菜群體的種群總遺傳變異(Ht)和群體內(nèi)遺傳變異(Hs)分別為0.240 2和0.177 8,群體間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.252 6,即群體間遺傳變異占總變異的25.3%,群體內(nèi)遺傳變異占總變異的74.7%,表明不同品系的群體間遺傳分化程度較低。2個(gè)壇紫菜群體間基因流動(dòng)系數(shù)(Nm)為1.593 0,表明壇紫菜不同品系間存在一定的基因交流。壇紫菜群體間遺傳相似度和遺傳距離見表4。

    2.4 2個(gè)品系壇紫菜聚類分析

    基于個(gè)體間的遺傳距離構(gòu)建UPGMA和NJ聚類圖(圖2)。聚類分析表明,60個(gè)壇紫菜個(gè)體分成 2支,ZN3號(hào)的30個(gè)個(gè)體聚成一支,YH的30個(gè)個(gè)體聚成另外一支。

    表4 群體間遺傳相似度和遺傳距離

    注:對(duì)角線上為遺傳相似度;對(duì)角線下為遺傳距離。

    圖2 基于遺傳距離的壇紫菜UPGMA(A)和NJ(B)聚類樹

    3 討論

    3.1 壇紫菜的遺傳多樣性

    物種或群體通過長(zhǎng)期的進(jìn)化積累豐富的遺傳變異,這些遺傳變異的總和構(gòu)成了物種或群體的遺傳多樣性[12]。國(guó)內(nèi)已有多位學(xué)者利用分子標(biāo)記技術(shù)探討壇紫菜種質(zhì)資源多樣性和遺傳差異[13-16],這些研究結(jié)果表明,壇紫菜的種質(zhì)資源多樣性是極為豐富的。而相對(duì)于其他DNA標(biāo)記技術(shù),AFLP標(biāo)記多態(tài)帶比例高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,不受基因組來(lái)源和復(fù)雜程度影響,重復(fù)性好并呈孟德爾遺傳的標(biāo)記,且在生物基因組信息未知的條件下,就能夠檢測(cè)親緣關(guān)系非常近的材料之間的差異[17-18]。

    本實(shí)驗(yàn)利用AFLP技術(shù)分析了ZN3和YH 2個(gè)群體共60個(gè)樣本,結(jié)果顯示,2個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率分別是69.0%和81.5%;其中YH群體的多態(tài)位點(diǎn)比例高于ZN3群體,這可能是因?yàn)閅H本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的種菜來(lái)源多樣且范圍大,而ZN3選育品系的種菜來(lái)源范圍較小,所以YH群體的遺傳多樣性較高。

    3.2 壇紫菜群體的遺傳結(jié)構(gòu)

    壇紫菜的遺傳結(jié)構(gòu)是由基因流和遺傳漂變2因素綜合決定的,基因流動(dòng)程度會(huì)對(duì)群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響,理論上,若Nm>1,則說(shuō)明群體間有一定程度的基因流動(dòng);若Nm<1,則說(shuō)明群體間分化明顯[12]。本研究中,2個(gè)壇紫菜群體間基因流動(dòng)系數(shù)Nm為1.593 0,表明其群體間存在一定的基因交流。目前紫菜養(yǎng)殖品種(系)間相互混雜,海區(qū)風(fēng)浪較大,這都增加了品種(系)間基因交流的機(jī)會(huì)[7]。從UPGMA和NJ聚類圖中可以看出,ZN3和YH 2個(gè)群體明顯分為2大支,群體之前并沒有個(gè)體混雜情況出現(xiàn),說(shuō)明本次樣品采集有效合理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

    綜上所述,本研究結(jié)果揭示了浙南傳統(tǒng)養(yǎng)殖壇紫菜和選育壇紫菜品系間的遺傳多樣性差異,為了解浙南周圍壇紫菜資源提供了一定的理論支持。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將會(huì)對(duì)更多浙南地區(qū)不同品系的壇紫菜樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。

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