姜黃素逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌HCT-116/5FU 細(xì)胞耐藥作用機(jī)制研究

徐 露 張鑫杰 張閏哲 姚慶華

結(jié)腸癌（colon cancer，CC）是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，占據(jù)我國惡性腫瘤發(fā)病和致死率的第四位[1]。目前治療方式仍以化療為主，而氟尿嘧啶（5-FU）作為中晚期結(jié)腸癌最主要的化療藥物，其化療耐藥致使的化療失敗案例并不少見。姜黃活血行氣，通經(jīng)止痛，而姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗老年癡呆癥等作用[2]。本研究旨在觀察姜黃素對結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT-116/5FU 細(xì)胞增殖、凋亡作用，探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的可能機(jī)制，報道如下。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株 人源結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116（美國ATCC 公司，批號CCL-247），HCT-116/5FU 耐藥株由浙江省中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗室通過HCT-116 親本株自行培養(yǎng)提供。

1.2 藥 品 姜黃素（批號G1304004）購于上海阿拉丁公司；氟尿嘧啶（5-FU，99.97%，批號s1209）購于美國Selleck 公司。姜黃素和5-FU 配置于二甲基亞砜溶液中（姜黃素存儲液濃度為100mM；5-FU 存儲液濃度為200mM）。

1.3 試 劑 640 培養(yǎng)基（批號8118241）購于美國Gibico 公司，二甲基亞砜（批號67-68-5）、噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（批號3580GR001）購于美國Sigma 公司，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號8072965）購于美國BD Biosciences 公司，一抗（批號9929T）購于美國cell Signaling 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、鼠二抗及兔二抗（批號A0216、A0208）購于上海碧云天公司。

1.4 儀 器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（山東BIOBASE 博科，型號QP-160）、酶標(biāo)儀（山東BIOBASE 博科，型號EL10A）、顯微鏡（日本奧林巴斯，型號BX43）、流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特，型號CytoFLEX S）、蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad，型號1645050）等儀器及設(shè)備均由中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗室提供。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-116/5FU 常規(guī)培養(yǎng)條件：使用含有10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，予37℃，5% CO2孵箱，另加5-FU 于1640 培養(yǎng)液中配置成100μM 的5-FU 維持培養(yǎng)，所有實(shí)驗均基于指數(shù)生長期細(xì)胞。胰酶消化時間3min，傳代比例1:2～1:4。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的HCT-116/5FU 細(xì)胞，消化后均勻吹打，以3000 個/孔接種在96 孔板中，24h 后加入5-FU 和姜黃素配置成不同摩爾濃度的培養(yǎng)基，48h 后加MTT 20μL 培養(yǎng)箱孵育4h，加入DMSO 150μL，搖勻后使用酶標(biāo)儀測定其在A570nm 波長處吸光值，并計算細(xì)胞生長抑制率。生長抑制率=（對照組A-處理組A）/對照組A×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測 HCT8 細(xì)胞的凋亡率HCT-116/5FU 細(xì)胞以2×105個/孔接種在6 孔板中，24h 后按四組予以不同藥物濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行換液（對照組：不含5-FU 及姜黃素的1640 培養(yǎng)基；5-FU 組：含5-FU 200μM 的1640 培養(yǎng)基；姜黃素組：含姜黃素20μM 的1640 培養(yǎng)基；聯(lián)合用藥組：含5-FU 200μM+姜黃素20μM 的1640 培養(yǎng)基），復(fù)孔3 個。換液后48h 收集細(xì)胞，加入5μL 50 mg/L Annexin V-FITC和10μL PI，搖勻后避光30min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞培養(yǎng)及分組步驟同上，藥物干預(yù)48h 后收集細(xì)胞，使用含有酶抑制劑的RIPA 裂解液提取總蛋白。BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，使用緩沖劑及雙蒸水配齊各樣品30μg，95℃變性5min，-20℃保存。電泳使用預(yù)制10% SDS-PAGE 凝膠板，電泳（100V 1h），冰浴轉(zhuǎn)膜（200mA 2h），封閉1h，一抗4℃冰箱搖晃過夜，次日二抗室溫孵育2h，最后使用Image Lab 軟件行圖像采集和分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0 及GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，計量資料的兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。實(shí)驗重復(fù)3 次，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素聯(lián)合5-FU 使用后耐藥株細(xì)胞形態(tài)變化HCT-116 親本細(xì)胞株及5-FU 耐藥細(xì)胞株皆貼壁生長，上皮樣單層排列，形態(tài)相似。聯(lián)合姜黃素使用后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)增大，生長速度變緩，且部分細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)。見圖1。

圖1 HCT-116/5FU 細(xì)胞形態(tài)

3.2 姜黃素與5-FU 聯(lián)用抑制結(jié)腸癌HCT-116 細(xì)胞增殖 酶標(biāo)儀檢測吸光度后計算HCT-116 及HCT-116/5FU 細(xì)胞株5-FU 作用48h 時的IC50 值，分別為12.78μM、＞1000μM（見圖2A）。相比單藥使用，5-FU 聯(lián)合姜黃素后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05，見表1）。從圖2B 的增殖抑制曲線中選取最佳用藥濃度：姜黃素取20μM，5-FU 取200μM。

3.3 姜黃素對耐藥株凋亡率影響 流式細(xì)胞檢測儀結(jié)果顯示，與對照組比較，5-FU 組、姜黃素組凋亡率有所升高，聯(lián)合用藥組凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01）。聯(lián)合用藥組與5-FU 組、姜黃素組比較，凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見表2，圖3。

圖2 HCT-116 親本及耐藥株細(xì)胞增殖曲線

表1 不同姜黃素、5-FU 濃度及聯(lián)合用藥后HCT-116/5FU細(xì)胞活性比較（）

表1 不同姜黃素、5-FU 濃度及聯(lián)合用藥后HCT-116/5FU細(xì)胞活性比較（）

注：單藥姜黃素組僅干預(yù)規(guī)定濃度姜黃素；單藥5-FU 組僅干預(yù)規(guī)定濃度5-FU；聯(lián)合用藥組按照規(guī)定濃度同時干預(yù)姜黃素和5-FU；5-FU為氟尿嘧啶；姜黃素與5-FU 規(guī)定濃度見表格第一、二列；與相同濃度單藥組比較，aP＜0.05

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注：對照組予不含5-FU 和姜黃素1640 培養(yǎng)基；5-FU 組予含5-FU 200μM 的1640 培養(yǎng)基；姜黃素組予含姜黃素20μM 的1640 培養(yǎng)基；聯(lián)合用藥組予含5-FU 200μM 和姜黃素20μM 的1640 培養(yǎng)基；5-FU 為氟尿嘧啶；與對照組比較，aP<0.01；與5-FU 組、姜黃素組比較，bP<0.05

圖3 HCT-116/5FU 細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

3.4 蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 檢測結(jié)果顯示，親本細(xì)胞HCT-116 的IL-6 及STAT3 蛋白表達(dá)量明顯低于耐藥細(xì)胞株HCT-116/5FU。干預(yù)用藥后，5-FU 組IL-6 及STAT3 表達(dá)下調(diào)，而cleaved-Casepase3 蛋白表達(dá)量無明顯差異。姜黃素組IL-6及STAT3 蛋白表達(dá)下調(diào)，并誘導(dǎo)cleaved-Casepase3蛋白表達(dá)。兩藥聯(lián)合使用時，cleaved-Casepase3 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，IL-6 及STAT3 蛋白表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)量的變化較單藥組更為明顯。見圖4。

圖4 細(xì)胞內(nèi)各蛋白表達(dá)差異

4 討論

5-FU 作為結(jié)直腸癌常用化療藥物，其耐藥是結(jié)直腸癌患者化療過程中亟待解決的關(guān)鍵問題，這主要由核苷代謝酶異常、代謝活性酶異常、DNA 修復(fù)系統(tǒng)激活、腫瘤微環(huán)境改變及EGFR-Akt、IL-6/STAT3等信號通路異常所導(dǎo)致[3-5]。而IL-6/STAT3 信號通路被證實(shí)參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，并有研究指出臨床常用的MEK 抑制劑因STAT3 的磷酸化激活導(dǎo)致胰腺癌及腸癌細(xì)胞耐藥，尋找靶向STAT3 的小分子抑制劑可能是治療耐藥的突破點(diǎn)[6-7]。而有實(shí)驗證據(jù)表明，姜黃素可作為STAT3 小分子抑制劑能通過抑制STAT3 的磷酸化和IL-6 的表達(dá)起到雙重抑制IL-6/STAT3 通路的作用[8-9]。因此，本研究旨在探究5-FU 耐藥是否和IL-6/STAT3 信號通路相關(guān)，進(jìn)一步探索姜黃素是否有逆轉(zhuǎn)耐藥的功能。研究結(jié)果顯示，IL-6 及STAT3 蛋白在耐藥株細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于親本株，預(yù)示耐藥株細(xì)胞的耐藥特性可能和IL-6/STAT3 信號通路有關(guān)。姜黃素能降低HCT-116/5FU 的細(xì)胞活性，增加細(xì)胞凋亡率，提示姜黃素能逆轉(zhuǎn)HCT-116/5FU 的耐藥水平。IL-6、STAT3 蛋白表達(dá)量的變化提示姜黃素可能是通過下調(diào)IL-6 及STAT3 實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)耐藥。此外，聯(lián)合用藥組凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase3 表達(dá)增加印證了姜黃素的促凋亡能力，提示姜黃素所致的凋亡可能和Caspase 家族有關(guān)?？偠灾S素逆轉(zhuǎn)5-FU 耐藥細(xì)胞可能和IL-6/STAT3 信號通路有關(guān)。

STAT 參與細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)等過程，其中STAT3 在腫瘤細(xì)胞中研究最廣泛[10]。研究表明，STATS 被磷酸化激活后可形成二聚體，入核與啟動子結(jié)合，調(diào)控下游多種靶向基因，參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移及免疫監(jiān)視等[11-13]。而IL-6 是STAT3 的上游激活因子，是重要的腫瘤抗凋亡因子之一，IL-6 通過活化IL-6Rβ 產(chǎn)生六聚體，繼而激發(fā)JAKs，而JAKs 反向調(diào)節(jié)IL-6Rβ 的磷酸化，致使STAT3 激活[14]。STAT3 也是EGFR、IL-6/JAK、Src 等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路匯聚的焦點(diǎn)，主導(dǎo)各信號通路間的交互作用使其成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心樞紐[15-16]。本研究從IL-6/STAT3 通路出發(fā)，探討姜黃素逆轉(zhuǎn)5-FU 耐藥的可能機(jī)制。而姜黃素因其低溶解性、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性及生物低利用度，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限。現(xiàn)有的臨床研究揭示了姜黃素治療癌癥的可能性，為了尋求更好的臨床應(yīng)用方式，需要更具體的研究揭示姜黃素的生物利用度及藥理作用[17]。

綜上所述，姜黃素能逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116/5FU 的5-FU 耐藥特性，其機(jī)制可能和下調(diào)IL-6/STAT3 有關(guān)。未來的研究進(jìn)一步探究姜黃素聯(lián)合用藥后所發(fā)生的凋亡率的提高是否單純與Caspase 半胱氨酸蛋白酶家族有關(guān)，同時可更具體的研究IL-6/JAKs/STAT3 通路，定位STAT3 激活過程中核外向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的異常增高。