木犀草素納米混懸劑的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià)

謝 慧，何佶彥

（湖北六七二中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430070）

木犀草素（Luteolin）最早是從木犀草科草本植物木犀草（Resedaodorata L.）中分離出來的一種黃酮類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)存在于菊科、唇形科、天南星科、十字花科、馬鞭草科等植物中。最初研究發(fā)現(xiàn)木犀草素具有以抗炎，抗氧化，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，改善記憶力等藥理作用[1]，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)對(duì)木犀草素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等藥理活性[2]。然而，木犀草素在水中溶解度極低（約為61 μg/mL），影響藥物體內(nèi)吸收，口服生物利用度較低[3-4]，限制了臨床應(yīng)用。為了提高木犀草素的溶解度及藥效，研究人員將其制備成聚合物納米粒[5]、白蛋白納米粒[6]、脂質(zhì)體[7]、固體分散體[8]等新型給藥系統(tǒng)。納米混懸劑是近年來開發(fā)的一種納米給藥系統(tǒng)，由于其粒徑較小，存在巨大的比表面積和界面能，能夠顯著增加難溶性藥物的溶解度及口服生物利用度[9-10]。因此，本研究將木犀草素制備成納米混懸劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了制備工藝參數(shù)并確定了處方中穩(wěn)定劑和表面活性劑的種類，并最終采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到木犀草素納米混懸劑的最優(yōu)處方，為木犀草素的動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

ESW-1.0小型濕法研磨機(jī)（上海易勒機(jī)電設(shè)備有限公司）；氧化鋯（ZrO2）珠研磨介質(zhì)（直徑為0.5 mm）；Zetasizer Nano ZS90 納米粒徑/電位分析儀（英國(guó)馬爾文公司）；JSM-7800F掃描電鏡（日本電子公司）；iChrom 5100系列高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；RCY-1400T智能溶出試驗(yàn)儀（天津市瑞斯德科技有限公司）。

木犀草素原料藥（西安唯奧生物科技有限公司，純度：98.5%，批號(hào)：20180923）；木犀草素對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，純度：99.5%，批號(hào)：MUST-18061407）；羥丙基纖維素（HPC SL，日本信越化學(xué)）；聚維酮（PVP K30，巴斯夫輔料公司）；羥丙甲纖維素（HPMC E5，陶氏化學(xué)）；泊洛沙姆（Poloxamer 188，巴斯夫輔料公司）；維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGs，巴斯夫輔料公司）；吐溫80（Tween-80，南京威爾藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 木犀草素納米混懸劑的制備 通過介質(zhì)碾磨法[11]制備木犀草素納米混懸劑。稱取一定量的穩(wěn)定劑（HPC SL、PVP K30或 HPMC E5）加入到純化水中溶解，再加入表面活性劑（Poloxamer 188、Tween-80或TPGs）溶解，備用。稱取一定量木犀草素加入到上述溶液中，分散，并加入到介質(zhì)碾磨機(jī)中，加入一定量ZrO2，以一定的速度進(jìn)行碾磨一定時(shí)間，取樣測(cè)定粒徑分布和Zeta電位，制備木犀草素納米混懸劑。

2.2 粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 取木犀草素納米混懸劑加入少量蒸餾水稀釋，用Zetasizer Nano ZS90納米粒徑/電位分析儀測(cè)定木犀草素納米混懸劑的粒徑分布和Zeta電位，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2.3 處方工藝篩選

2.3.1 穩(wěn)定劑種類篩選 文獻(xiàn)報(bào)道[12]納米混懸劑處方中加入穩(wěn)定劑及表面活性劑可以提高體系的穩(wěn)定性。本研究固定藥物濃度為30 mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，每個(gè)處方中分別加入濃度為2%的HPC SL、PVP K30和HPMC E5作為穩(wěn)定劑制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選穩(wěn)定劑。研究結(jié)果表明，不同種類的穩(wěn)定劑會(huì)對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑及Zeta電位大小產(chǎn)生一定的影響，使用HPC SL作為穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑粒徑分布最小，Zeta電位較低，因此本研究使用HPC SL作為穩(wěn)定劑制備木犀草素納米混懸劑。

2.3.2 穩(wěn)定劑濃度篩選 固定藥物濃度為30mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，在處方中分別加入濃度為 0.5、0.75、1、2、5%的 HPC SL 制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選穩(wěn)定劑濃度。研究驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定劑濃度對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑及Zeta電位產(chǎn)生一定的影響，隨著穩(wěn)定劑濃度的增大，制備的納米混懸劑粒徑增大，Zeta電位隨著穩(wěn)定劑的濃度增加而增大，因此穩(wěn)定劑的濃度需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.3 表面活性劑種類篩選 文獻(xiàn)報(bào)道[13]納米混懸劑中的表面活性劑種類會(huì)對(duì)其粒徑及穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。固定藥物濃度為30 mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，HPC SL濃度為2%，處方中分別加入濃度為0.2%的Poloxamer 188、TPGs和Tween-80作為表面活性劑制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選表面活性劑。研究結(jié)果表明，不同種類的表面活性劑會(huì)對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑及Zeta電位大小產(chǎn)生一定的影響，使用TPGs作為表面活性劑制備的納米混懸劑粒徑分布最小，Zeta電位較低，因此本研究使用TPGs作為表面活性劑制備木犀草素納米混懸劑。

2.3.4 表面活性劑濃度篩選 固定藥物濃度為30 mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，HPC SL濃度為2%，在處方中分別加入濃度為 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3%的TPGs制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選表面活性劑濃度。研究結(jié)果表明，表面活性劑濃度對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑影響不大，但對(duì)Zeta電位影響較為顯著，隨著TPGs濃度的增大，Zeta電位升高，因此表面活性劑濃度需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.5 藥物濃度篩選 固定碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，HPC SL濃度為2%，TPGs濃度為0.2%，藥物濃度分別為 10、20、30、40 mg/mL 制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選表面活性劑。研究結(jié)果表明，藥物濃度對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑具有一定影響，隨著藥物濃度的增大，納米混懸劑的粒徑先減小后增大，而藥物濃度對(duì)Zeta電位影響不顯著，因此藥物濃度需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.6 碾磨介質(zhì)用量篩選 固定藥物濃度為30mg/mL，碾磨速度為2 500 r/min，碾磨時(shí)間為4 h，HPC SL濃度為2%，TPGs濃度為0.2%，分別選擇碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為 0.2∶1，0.4∶1，0.6∶1，0.8∶1，1∶1，制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選碾磨介質(zhì)用量。研究結(jié)果表明，碾磨介質(zhì)體積對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑具有一定的影響，隨著碾磨介質(zhì)體積的增加，制備的納米混懸劑粒徑逐漸減小，碾磨介質(zhì)體積對(duì)Zeta電位影響不顯著，因此本研究確定碾磨介質(zhì)體積與混懸劑體積之比為 1∶1。

2.3.7 碾磨時(shí)間篩選 固定藥物濃度為30 mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨速度為2 500 r/min，HPC SL濃度為2%，TPGs濃度為0.2%，分別選擇碾磨時(shí)間為1、2、4、6 h，制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選碾磨時(shí)間。研究結(jié)果表明，碾磨時(shí)間對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑產(chǎn)生一定的影響，對(duì)Zeta電位影響不顯著，隨著碾磨時(shí)間的增加，制備的納米混懸劑粒徑逐漸減小，但是碾磨時(shí)間達(dá)到6 h，粒徑不再減小，因此確定碾磨時(shí)間為4 h。

2.3.8 碾磨速度篩選 固定藥物濃度為30 mg/mL，碾磨介質(zhì)與混懸劑體積之比為1∶1，碾磨時(shí)間為4 h，HPC SL濃度為2%，TPGs濃度為0.2%，分別選擇碾磨速度為 1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 r/min，制備木犀草素納米混懸劑，測(cè)定粒徑分布及Zeta電位，篩選碾磨速度。研究結(jié)果表明，碾磨速度對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑產(chǎn)生一定的影響，對(duì)Zeta電位影響不顯著，隨著碾磨速度的增加，制備的納米混懸劑粒徑逐漸減小，但是碾磨速度超過2500r/min，粒徑不再減小，因此確定碾磨速度為2 500 r/min。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，以藥物濃度（X1），穩(wěn)定劑濃度（X2）和表面活性劑濃度（X3）作為考察因素，以木犀草素納米混懸劑的粒徑分布（Y1）布和 Zeta電位（Y2）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化木犀草素納米混懸劑的處方，3個(gè)變量水平見表1，生成的15組實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中變量及水平Tab.1 Variables and levels of Box-Behnken experiment design

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The experimental design and results

2.4.2 數(shù)據(jù)處理及模型擬合 通過“Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，兩個(gè)模型P值均為 0.000 8，小于 0.05，表明兩個(gè)擬合模型均顯著；模型中R2和矯正R2用于估模型方程的可接受性，Y1的 R2值和矯正 R2值分別為 0.982 2 和 0.950 2，Y2的 R2值和矯正 R2值分別為 0.981 4 和 0.947 8，之間差值均小于0.1，說明兩個(gè)模型可信度較高；失擬項(xiàng) P 值分別為 0.254 6 和 0.236 1，均大于 0.05，說明兩個(gè)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型預(yù)測(cè)性較高。Y1和Y2響應(yīng)值與3個(gè)自變量之間的相關(guān)性均符合多元二次方程模型。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 The results of ANOVA

另外，通過方差分析結(jié)果可知3個(gè)變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系，即：X1、X2、X2X3、X12對(duì)粒徑分布（Y1）具有顯著影響（P＜0.05），而 X2、X3、X2X3對(duì) Zeta 電位（Y2）具有顯著影響（P＜0.05）。自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系見圖1、2。

由效應(yīng)面圖1可知，木犀草素納米混懸劑的粒徑隨著藥物濃度的增加先減小后增大，隨著穩(wěn)定劑濃度的增加粒徑增大，表面活性劑濃度對(duì)粒徑的影響可以忽略不計(jì)。

由效應(yīng)面圖2可知，木犀草素納米混懸劑的Zeta電位隨著穩(wěn)定劑濃度的增加而升高，也隨著表面活性劑濃度的增加而升高，藥物濃度對(duì)Zeta電位的影響可以忽略不計(jì)。

圖1 藥物濃度（X1），穩(wěn)定劑濃度（X2）、表面活性劑濃度（X3）對(duì)木犀草素納米混懸劑的粒徑分布（Y1）的效應(yīng)面圖Fig.1 Effect of luteolin concentration(X1)，stabilizer concentration(X2)，surfactant concentration(X3)on the particle size distribution(Y1)of luteolin nanosuspension

圖2 藥物濃度（X1），穩(wěn)定劑濃度（X2）、表面活性劑濃度（X3）對(duì)木犀草素納米混懸劑的Zeta電位（Y2）的效應(yīng)面圖Fig.2 Effect of luteolin concentration(X1)，stabilizer concentration(X2)，surfactant concentration(X3)on Zeta potential(Y2)of luteolin nanosuspension

2.4.3 模型預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 本研究確定木犀草素納米混懸劑的處方應(yīng)具有粒徑分布“最小”，Zeta電位“最小”，通過“Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”優(yōu)化得到木犀草素納米混懸劑的最優(yōu)處方組成為：藥物濃度為28.0 mg/mL，穩(wěn)定劑濃度為1.5 mg/mL，表面活性劑濃度為0.2 mg/mL，軟件預(yù)測(cè)木犀草素納米混懸劑的粒徑為332.2 nm，Zeta電位為-30.5 mV。根據(jù)優(yōu)化的木犀草素納米混懸劑處方制備3批樣品，經(jīng)測(cè)定粒徑為（324.3±21.6）nm，Zeta電位為（-31.4±0.9）mV，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，模型預(yù)測(cè)可靠性較高。

2.5 微觀形態(tài) 取木犀草素納米混懸劑加入少量蒸餾水稀釋，取1滴樣品滴加到載玻片上，揮干水分，噴金，放在掃描電鏡下觀察木犀草素納米混懸劑的微觀形態(tài)。掃描電鏡照片顯示木犀草素納米混懸劑呈顆粒狀均勻分布，粒徑大約在100～500 nm之間。見圖3。

圖3 木犀草素納米混懸劑掃描電鏡（×20 000）Fig.3 The scanning electron microscope of luteolin nanosuspension(×20 000)

2.6 體外釋放研究 使用槳法測(cè)定木犀草素納米混懸劑與木犀草素原料藥的體外溶出度。溶出介質(zhì)為0.5%（w/w）吐溫-80磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8），體積為500 mL，槳板轉(zhuǎn)速為50 r/min，水浴溫度為37℃。開啟溶出儀，用移液器精密移取0.5 mL木犀草素納米混懸劑加入到溶出杯中，分別在5、10、20、30、45、60 min取樣 5 mL 溶出介質(zhì)，20 000 r/min高速離心，取1 mL上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋，使用HPLC法[14]測(cè)定藥物含量；另取15 mg木犀草素原料藥加入到溶出杯中，按照上述方法操作，測(cè)定藥物含量。通過繪制時(shí)間-溶出度曲線比較木犀草素納米混懸劑與木犀草素原料藥的溶出度。見圖4。

由木犀草素納米混懸劑與木犀草素原料藥溶出曲線可知，木犀草素原料藥在10 min累積溶出度為18.3%，30 min累積溶出度為34.4%，60 min累積溶出度為42.2%，體外累積溶出度數(shù)據(jù)經(jīng)威布爾方程擬合為：lnln[1/（1-C（t））]=0.6054ln（t）-2.994 9（R2=0.988 9），經(jīng)計(jì)算體外累積溶出度50%的時(shí)間為77.6 min，累積溶出度63.2%的時(shí)間為89.6 min；而木犀草素納米混懸劑在10 min溶出度為76.4%，30 min溶出度為96.3%，60 min溶出度98.7%，體外累積溶出度數(shù)據(jù)經(jīng)威布爾方程擬合為：lnln[1/（1-C（t））]=0.771 8ln（t）-1.573 3（R2=0.971），經(jīng)計(jì)算體外累積溶出度50%的時(shí)間為4.8 min，累積溶出度63.2%的時(shí)間為7.7 min，表明木犀草素納米混懸劑能夠顯著提高藥物溶出度。

圖4 木犀草素納米混懸劑與木犀草素原料藥體外溶出曲線（n=6）Fig.4 In vitro release curve of luteolin nanosuspension and luteolin(n=6)

3 討論

目前，藥物納米粒子的制備技術(shù)從原理上可分為“自上而下”（Top-down）和“自下而上”（Bottomup）兩種制備技術(shù)[15]?！白韵露稀狈譃榉慈軇┏恋矸ê突瘜W(xué)反應(yīng)沉淀法，“自上而下”分為介質(zhì)碾磨法、高壓均質(zhì)法和微射流法，由于介質(zhì)碾磨法在納米混懸劑制劑生產(chǎn)中具有高度的可重現(xiàn)性、可避免碾磨腔體遞質(zhì)污染、易于規(guī)模放大，因此本研究選用介質(zhì)碾磨法制備木犀草素納米混懸劑。

納米混懸劑屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，在處方中需要添加穩(wěn)定劑以降低液-固界面張力，提高體系的穩(wěn)定性。本研究在木犀草素納米混懸劑的處方中加入HPC SL和TPGs作為穩(wěn)定劑，HPC SL可以吸附到納米混懸劑表面，形成一層薄膜，阻礙顆粒之間的聚集，起到空間位阻作用，而表面活性劑TPGs可降低了藥物與水之間的界面張力，潤(rùn)濕藥物表面，通過穩(wěn)定劑與表面活性物質(zhì)的雙重作用提高了木犀草素納米混懸劑的穩(wěn)定性。