黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌CTGF及FN1表達(dá)的影響*

尹 超，王朋宇，胡艷云，馬朝朋，王曉妍

（保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌三科，保定 071000）

糖尿病性心肌病是發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來(lái)解釋的心肌疾病[1]。其在代謝紊亂及微血管病變之基礎(chǔ)上引起心肌廣泛灶性壞死，出現(xiàn)心功能異常，最終進(jìn)展為心力衰竭及心源性休克，甚至猝死[2]。充血性心力衰竭為糖尿病心肌病的主要臨床表現(xiàn)[3]。由于心肌灶性壞死、纖維瘢痕形成，引起心肌電生理特性不均一而導(dǎo)致心律失常[4]。在糖尿病患者中，女性并發(fā)充血性心力衰竭的概率約為男性的2倍。黃連地黃湯組成為黃連（去須）、生地、天花粉、五味子（去梗）、川當(dāng)歸、人參（去蘆）、干葛、白茯苓（去皮）、麥門冬（去心）、甘草，功效為滋陰清熱，生津止渴，治陰虛火旺之消渴?，F(xiàn)代常用于糖尿病性心肌病屬陰虛火旺證者[5]。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠80只，雌性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。

1.2 受試藥物及試劑 檸檬酸，購(gòu)于天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20171024。檸檬酸三鈉，購(gòu)于天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170706。。鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：170325。水合氯醛：購(gòu)于天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20161219。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)定試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20171221?？偰懝檀迹═C）測(cè)定試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20171203。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20171117。丙二醛（MDA）測(cè)試盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20171215。葡萄糖，購(gòu)于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170213。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗體（CTGF），購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171228。纖維連接蛋白抗體（FN1），購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171115。鹽酸二甲雙胍片，購(gòu)于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：20170421。鹽酸苯那普利片，購(gòu)于北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20170716。TMS-P超敏試劑盒，購(gòu)于福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：12/2017。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)：20171005。無(wú)水乙醇，購(gòu)于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170910。

黃連地黃湯人用法用量為黃連（去須）、生地、天花粉、五味子（去梗）、川當(dāng)歸、人參（去蘆）、干葛、白茯苓（去皮）、麥門冬（去心）、甘草各 3 g，用水600 mL煎，去渣溫服，每日2次。本研究所需藥物濃度分別為生藥 0.27、0.54、1.08 g/mL，取以上藥物各45.36g，共計(jì) 453.6g，分 2 次煎煮，合計(jì)加水 9072mL，合并2次煎液，濃縮至420 mL，制成濃度為生藥1.08 g/mL的濃縮液，每周制備1次，分為7等份密封冷藏保存，灌胃時(shí)用蒸餾水等倍稀釋為生藥0.54 g/mL 和生藥 0.27 g/mL。

1.3 儀器 金華科迪KD-P生物組織攤片機(jī)。安穩(wěn)+型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司。金華科迪KD-202型病理切片機(jī)。金華科迪KD-H生物組織烤片機(jī)。BX53型奧林巴斯顯微鏡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、造模、給藥 80只雌性SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)選取10只為空白對(duì)照組，其余大鼠隨機(jī)分為模型組、黃連地黃湯低劑量組（2.7 g/kg生藥）、黃連地黃湯中劑量組（5.4 g/kg生藥）、黃連地黃湯高劑量組（10.8 g/kg生藥）、二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組（90 mg/kg，0.9 mg/kg），每組 14 只。先用高脂高糖飼料（普通飼料66.5%、豬油10%、蔗糖15%、蛋黃7%、膽酸鈉0.5%、膽固醇1%）喂養(yǎng)6周，然后大鼠禁食12 h，除空白對(duì)照組外其余大鼠腹腔注射濃度為44 mg/kg的STZ，STZ使用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.0）配置[6]。注射 STZ 的第 3 天，測(cè)大鼠空腹血糖，血糖大于11.1 mmol/L認(rèn)為2型糖尿病模型成功，剔除血糖不合格大鼠，各給藥組灌胃體積為10 mL/kg，空白對(duì)照組及模型組灌胃等體積的蒸餾水，血糖符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠繼續(xù)喂飼高脂高糖飼料，邊造模邊給藥12周，末次給藥后測(cè)大鼠空腹血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清 LDL-C、TC、SOD、MDA，最后取心臟用福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化檢測(cè)心肌CTGF及FN1表達(dá)。

1.4.2 心肌組織HE染色 切片脫蠟至水，常規(guī)HE染色。中性樹(shù)膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞損傷程度。

1.4.3 免疫組化法測(cè)定心肌細(xì)胞CTGF及FN1表達(dá) 切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5 min。蒸餾水沖洗，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清。滴加Ⅰ抗（CTGF 1∶300；FN1 1∶400），于 37 ℃孵育 2 h。PBS 緩沖液沖洗3次，每次3 min。滴加適量生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，于37℃孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，于37℃孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。免疫組化圖片采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠模型血糖及血脂的影響 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比模型組空腹血糖值顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組空腹血糖值顯著降低（P＜0.01）。與空白對(duì)照組相比，模型組治療后LDL-C顯著升高（P＜0.01），與模型組相比黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組治療后LDL-C顯著降低（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比模型組血清TC顯著升高（P＜0.01），與模型組相比黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組治療后血清TC顯著降低（P＜0.05）。

表1 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on fasting blood glucose，LDL-C and TC contents in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

表1 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on fasting blood glucose，LDL-C and TC contents in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 治療后空腹血糖值 LDL-C TC空白對(duì)照組 10 — 5.45±1.09 0.42±0.07 1.38±0.21模型組 14 — 20.31±4.82* 0.78±0.05* 2.15±0.43*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg生藥 17.59±3.57 0.63±0.06# 2.02±0.34黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg生藥 15.75±3.84# 0.59±0.05# 1.87±0.32黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg生藥 14.33±3.61# 0.55±0.07# 1.71±0.27#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg 11.92±2.52## 0.51±0.05# 1.62±0.29#苯那普利對(duì)照組 0.9 mg/kg

2.2 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠模型抗氧化能力的影響 見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組相比，模型組MDA 顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組MDA顯著降低（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，模型組SOD 顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組血清SOD顯著增加（P＜0.05）。

表2 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠MDA和SOD的影響（±s）Tab.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on MDA and SOD in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

表2 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠MDA和SOD的影響（±s）Tab.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on MDA and SOD in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 MDA SOD空白對(duì)照組 10 — 3.26±0.49 274.53±35.23模型組 14 — 8.21±2.27* 147.54±19.63*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg 生藥 7.38±1.93 167.28±20.75黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg 生藥 6.44±1.86 175.85±17.74#黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg 生藥 5.73±1.74# 189.53±18.65#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg， 5.17±1.49# 221.57±23.41#苯那普利對(duì)照組 0.9 mg/kg

2.3 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠模型心肌損傷的影響 見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組大鼠心肌細(xì)胞無(wú)病變；模型對(duì)照組大鼠部分心肌細(xì)胞溶解消失，且呈現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)；各治療組大鼠心肌均出現(xiàn)局灶性損傷及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，但其損傷程度較模型組有所減輕。

2.4 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠模型心肌細(xì)胞CTGF及FN1表達(dá)的影響 見(jiàn)表3，圖2、3。與空白對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞CTGF表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組心肌細(xì)胞CTGF表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞FN1表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對(duì)照組心肌細(xì)胞 FN1 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。

圖1 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的影響Fig.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on myocardial damage in diabetic cardiomyopathy rats

表3 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌細(xì)胞CTGF及 FN1 表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF and FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（±s）

表3 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌細(xì)胞CTGF及 FN1 表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF and FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 CTGF灰度值 FN1灰度值空白對(duì)照組 10 — 158.72±17.34 114.45±16.72模型組 14 — 73.27±9.48* 169.32±19.65*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg生藥 98.37±12.62#143.87±19.29#黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg 生藥 109.69±15.53#132.64±17.59#黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg生藥 123.78±16.83#129.47±18.16#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg，苯那普利對(duì)照組 0.9 mg/kg 126.48±17.51#126.84±14.39#

3 討論

圖2 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌細(xì)胞CTGF表達(dá)的影響（×200）Fig.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（×200）

圖3 黃連地黃湯對(duì)糖尿病性心肌病大鼠心肌病大鼠心肌細(xì)胞FN1表達(dá)的影響（×200）Fig.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（×200）

糖尿病性心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者，在代謝紊亂及微血管病變之基礎(chǔ)上引發(fā)心肌廣泛灶性壞死，出現(xiàn)亞臨床的心功能異常，最終進(jìn)展為心力衰竭，重癥患者甚至猝死[8]。心肌細(xì)胞代謝紊亂糖尿病患者的收縮蛋白發(fā)生糖基化，導(dǎo)致其功能異常。心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷隨著心肌細(xì)胞外葡萄糖水平的升高直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，2型糖尿病的心肌細(xì)胞鈉鈣交換受到抑制，鈣離子（Ca2+）濃聚于肌漿網(wǎng)，Ca2+超負(fù)荷的心肌肌漿網(wǎng)，心肌舒張時(shí)張力增高，心臟的順應(yīng)性下降[9]。糖尿病患者心肌存在彌漫性心肌壁內(nèi)小血管病變。糖尿病病程較久由糖基化的膠原沉積引起心肌間質(zhì)纖維化[10]。糖尿病患者血脂增高能促進(jìn)血管壁細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取，極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?，LDL-C糖化損害肝細(xì)胞上的相關(guān)受體對(duì)其識(shí)別從而使LDL-C代謝減慢[11]。LDL-C與另外受體結(jié)合被巨噬細(xì)胞優(yōu)先吞噬和降解，堆積在巨噬細(xì)胞內(nèi)成為泡沫細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊的形成[12]。糖尿病患者在血糖控制不良時(shí)，三酰甘油含量增加，氧化脂蛋白酶活性增高，LDL-C增加，均成為血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)毒性因素。糖尿病心肌病為與代謝相關(guān)的廣泛性心肌損害，心肌細(xì)胞肥大、變性、灶性壞死、壞死區(qū)為纖維組織取代。針對(duì)糖尿病性心肌病目前無(wú)特效的治療方法，雖然尚不明確血糖控制是否改變糖尿病性心肌病的病程，仍應(yīng)及時(shí)控制高血糖[13]。治療高血壓是本病的基本治療措施。研究表明中度肥胖的糖尿病患者左室舒張期明顯僵硬，糖尿病患者較正常人群患高脂血癥的概率高，因此需進(jìn)行降血脂治療[14]。黃連地黃湯對(duì)血糖血脂血壓均有影響，黃連煎劑和小檗堿還有降低血糖的作用，黃連水浸液可使血清膽固醇含量降低。當(dāng)歸流浸膏有抗心律不齊和降壓作用[15]。當(dāng)歸能抗心肌缺血缺氧。葛根素可抗高血壓，防治AS，葛根素可明顯限制犬實(shí)驗(yàn)性急性心肌梗死范圍[16]。本研究結(jié)果表明黃連地黃湯可顯著降低糖尿病性心肌病模型大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量，同時(shí)提高糖尿病性心肌病模型大鼠抗氧化能力。

CTGF對(duì)成纖維細(xì)胞具有趨化及促有絲分裂作用，CTGF與包括心臟、腎臟及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。CTGF因具有明顯的趨化性，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖。外源性CTGF可刺激大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC）增殖及黏附。CTGF在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[18]。FN是一種纖維連接蛋白，參與細(xì)胞黏附、分化、傷口愈合、凝血和機(jī)體防衛(wèi)。主要分布于結(jié)締組織和大部分基底膜上，纖維連接蛋白有促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)細(xì)胞與纖維基質(zhì)間連接的生理作用[19]。纖連蛋白與機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)有密切關(guān)系。纖維連接蛋白可用于治療血液系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)疾病。隨著血管硬化程度的增加FN1含量呈下降趨勢(shì)。血漿FN1缺乏會(huì)引起微血管完整性的破壞和通透性升高，導(dǎo)致血漿大量外滲，血液濃縮，黏度增高，有效循環(huán)血量減少，血漿與組織液內(nèi)平衡失調(diào)，引起機(jī)體休克等危險(xiǎn)情況[20]。糖尿病患者的成纖維細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成發(fā)生改變，F(xiàn)N1與膠原的比例降低，即膠原相對(duì)含量升高[21]。在糖尿病和下肢靜脈潰瘍中，F(xiàn)N1含量明顯降低。本研究結(jié)果表明黃連地黃湯可顯著降低糖尿病性心肌病模型大鼠心肌細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，顯著增加心肌細(xì)胞細(xì)胞黏附蛋白的表達(dá)，具有明顯的抗心肌損害及心肌細(xì)胞纖維化的作用。

綜上所述，黃連地黃湯可通過(guò)降低糖尿病性心肌病模型大鼠空腹血糖值、LDL-C、TC含量及心肌細(xì)胞CTGF的表達(dá)，增加其抗氧化能力及心肌細(xì)胞FN1的表達(dá)，最終產(chǎn)生抗心肌細(xì)胞損害及纖維化的作用。