補(bǔ)腎抗衰片對動脈粥樣硬化模型血管周圍脂肪炎癥的實(shí)驗(yàn)研究*

王銘揚(yáng)，仲愛芹，熊 鑫，許曉敏，李艷陽，辛 穎，張 寧，謝盈彧，王愛迪，田立俊，張軍平，王清泉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

血管周圍脂肪組織（PVAT）指僅附著于血管外膜層的脂肪組織，主要由脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等構(gòu)成，圍繞著除腦血管外的全身各處血管（大到主動脈，小到真皮層微血管），尤其是冠狀動脈和主動脈[1]。目前研究認(rèn)為，PVAT是一種在形態(tài)和功能上均不同于皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的新的脂肪組織，除了具有保護(hù)性生理功能外，也有病理性特性[2]。在病理狀態(tài)下，通過改變自身的內(nèi)分泌、旁分泌功能，改變血管壁的結(jié)構(gòu)和功能，參與如動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生[3-4]。在AS發(fā)生發(fā)展過程中，血管壁的炎癥反應(yīng)是主要機(jī)制之一[5]，而PVAT與血管外膜之間不存在解剖學(xué)屏障，可以分泌多種介質(zhì)（脂肪因子和細(xì)胞因子）參與血管壁的炎性反應(yīng)。其中脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素等，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血漿纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）等[6]，這些因子通過直接浸潤的旁分泌途徑，直接進(jìn)入動脈內(nèi)，或通過滋養(yǎng)血管分泌途徑“由外到內(nèi)”作用于動脈管壁的各層細(xì)胞（外膜成纖維細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞、內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞），調(diào)節(jié)他們的生長、凋亡、基質(zhì)蛋白分泌、功能狀態(tài)及其他表型，參與AS的發(fā)生發(fā)展[7-9]。對其深入研究，可能為AS相關(guān)性疾病的治療提供新靶點(diǎn)。補(bǔ)腎抗衰片臨床應(yīng)用30余年來，治療AS相關(guān)性疾病療效確切[10-11]，團(tuán)隊(duì)前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其具有較好抗AS效果[12-14]，但作用機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究建立AS模型，以補(bǔ)腎抗衰片為干預(yù)藥物，觀察其對PVAT組織的影響，進(jìn)而檢測相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，探討其是否對PVAT炎癥的表達(dá)具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 補(bǔ)腎抗衰片（組成：丹參、夏枯草、何首烏、茯苓、黨參、菟絲子、桑寄生等），每片0.5 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。阿托伐他汀鈣片，每片10 mg，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字H20051407。

1.2 試劑 Anti-TNF-α抗體（MR0604，UCallM 公司）；Anti-Leptin抗體（ab16227，Abcam 公司）；Anti-MMP-9抗體 （MAB3309，Merck公司）；Goat anti Mouse IgG（H+L）-HRP（SA-2011H，UCallM 公司）；Goat anti Rabbit IgG （H+L）-HRP（SA-2021H，UCallM公司）；DAB顯色試劑盒（AR1022，博士德生物工程有限公司）。

1.3 模型制備及分組給藥 清潔級健康雄性新西蘭兔 24 只，體質(zhì)量（2.2±0.2）kg，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（動物許可證號：SCXK京2010-0002）。將其隨機(jī)分為對照組、模型組、補(bǔ)腎抗衰組、阿托伐他汀組。采用高脂飼養(yǎng)法復(fù)制AS模型，對照組給予普通飼料，其余各組持續(xù)予高脂飼料（1.5%膽固醇+5%豬油+9%蛋黃粉+0.2%膽酸+84.3%普通飼料，購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司）喂養(yǎng)同時(shí)，兩給藥組于4周后分別給予補(bǔ)腎抗衰片1.0 g/（kg·d）（片劑質(zhì)量）、阿托伐他汀鈣片5 mg/（kg·d）（片劑質(zhì)量）[15]，連續(xù)干預(yù)8周。

1.4 取材及病理形態(tài)學(xué)檢測 末次給藥后，禁食12 h（正常飲水），各組動物麻醉、固定，心臟灌注后取附著PVAT的胸主動脈，石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察主動脈病理形態(tài)學(xué)變化，采用Image-pro plus圖像分析軟件分析，每個(gè)目標(biāo)血管各取6張切片，每張切片取1個(gè)血管環(huán)均測量2次取平均值，最后計(jì)算6個(gè)血管環(huán)所得的數(shù)據(jù)均值作為該標(biāo)本的最終數(shù)值。計(jì)算參數(shù)如下：1）內(nèi)膜增生面積=內(nèi)彈力層圍繞面積（IELA）-血管環(huán)管腔橫截面積（LA）；2）中膜面積=外彈力層圍繞面積（EELA）-IELA；3）內(nèi)中膜比值（IMR）=內(nèi)膜增生面積/中膜面積，反映內(nèi)膜增生程度。

觀察PVAT脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，用Imagepro plus圖像軟件分析系統(tǒng)測量脂肪細(xì)胞的大?。ㄖ睆剑Ｃ繌埱衅?0×40倍鏡下，隨機(jī)取3個(gè)視野，測量該視野內(nèi)全部完整脂肪細(xì)胞直徑，計(jì)算平均值作為最終數(shù)值。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測 主動脈及血管外周脂肪組織TNF-α、瘦素、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)石蠟切片脫蠟至蒸餾水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原微波修復(fù)，5%BSA封閉液封閉30 min，不洗，滴加Ⅰ抗（抗體稀釋比例分別為：TNF-α 1∶50、Leptin 1∶500、MMP-9 1∶500），4 ℃孵育過夜，復(fù)溫，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗5次，每次5 min，滴加Ⅱ抗，孵育 30 min，孵育SABC30min，DAB 顯色 5～10min，蘇木精復(fù)染，脫水、透明后封片。光鏡下觀察，陽性表達(dá)為出現(xiàn)黃褐色顆粒，隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的視野，用Image-Pro Plus軟件，測量胸主動脈內(nèi)膜陽性染色面積占內(nèi)膜面積百分?jǐn)?shù)及PVAT組織陽性染色面積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 觀察各組動物的一般情況（皮毛、精神狀態(tài)、反應(yīng)、飲食、糞便等），稱量體質(zhì)量變化，剔除進(jìn)食不佳、狀態(tài)不好及血脂不穩(wěn)定者。

2.2 補(bǔ)腎抗衰片對AS模型兔主動脈內(nèi)膜病理學(xué)的影響 見圖1。對照組主動脈內(nèi)膜層薄、完整、連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，沒有斑塊。模型組內(nèi)膜明顯增厚，不連續(xù)甚至缺失，大量泡沫細(xì)胞堆積在整個(gè)管腔內(nèi)部，向管腔內(nèi)凸起，大量平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜下或可見泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積于內(nèi)膜下形成脂質(zhì)核心。與模型組比較，阿托伐他汀組和補(bǔ)腎抗衰片組中內(nèi)膜增生程度均不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表 1。

圖1 AS模型主動脈病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色×100）Fig.1 Pathological of aorta in AS model(HE staining×100)

表1 各組動物主動脈內(nèi)/中膜面積比（±s）Tab.1 Ratio of aortic neointima to media area in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) I M R對照組 6 0.0 7±0.0 2模型組 6 1.8 2±0.1 2*阿托伐他汀組 6 0.9 4±0.0 9##補(bǔ)腎抗衰片組 6 1.5 2±0.2 3#

2.3 補(bǔ)腎抗衰片對AS模型兔PVAT脂肪細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)的影響 見圖1。對照組PVAT由大量群集的單泡脂肪細(xì)胞構(gòu)成，呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，空泡狀排列規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)。脂肪細(xì)胞直徑從小到大依次是：對照組、阿托伐他汀組、補(bǔ)腎抗衰片組、模型組。與對照組比較，模型組脂肪細(xì)胞直徑增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，兩給藥組細(xì)胞直徑均有不同程度的減小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4 補(bǔ)腎抗衰片對AS模型主動脈及血管外周脂肪組織炎癥的影響

2.4.1 TNF-α免疫組化染色結(jié)果 對照組主動脈內(nèi)未見黃褐色顆粒表達(dá)，模型組增生的內(nèi)膜中可見大量深褐色顆粒表達(dá)；與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達(dá)面積均不同程度的減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為 P＜0.05），見圖 2、表 3。

表2 各組動物PVAT脂肪細(xì)胞直徑（±s）Tab.2 PVAT fat cell diameter in each group（±s） μm

表2 各組動物PVAT脂肪細(xì)胞直徑（±s）Tab.2 PVAT fat cell diameter in each group（±s） μm

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別 動物數(shù) 直徑對照組 6 258.75±86.28模型組 6 380.00±63.36*阿托伐他汀組 6 295.50±88.90補(bǔ)腎抗衰片組 6 311.25±62.11

圖2 各組動物主動脈TNF-α免疫組化染色結(jié)果（×100）Fig.2 Immunohistochemical staining results of TNF-α in aorta of each group(×100)

表3 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織TNF-α蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.3 Expression of TNF-α protein in the aorta and PVAT of each group（±s）

表3 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織TNF-α蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.3 Expression of TNF-α protein in the aorta and PVAT of each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補(bǔ)腎抗衰片組 6面積比百分?jǐn)?shù)（%）0.0 0±0.0 0 3 4.5 8±5.5 6 2 0.7 6±5.4 1#2 1.9 6±6.2 8#面積1 7 0 3 2± 6 5 8 9.4 8 4 8 4 3 5±1 0 2 7 3.3 2*2 7 3 2 2±1 0 3 5 5.8 7#3 0 9 7 0± 8 0 5 4.1 3#

對照組PVAT脂肪細(xì)胞膜可見少量黃褐色顆粒表達(dá)。與對照組比較，模型組可見大量深褐色顆粒表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達(dá)面積均有不同程度的減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為 P＜0.05），見圖 3、表 3。

圖3 各組動物血管周圍脂肪組織TNF-α免疫組化染色結(jié)果（×100）Fig.3 Immunohistochemical staining results of TNF-α in PVAT tissues of each group(×100)

2.4.2 瘦素免疫組化染色結(jié)果 對照組主動脈內(nèi)膜可見少量黃色顆粒表達(dá)。與對照組比較，模型組內(nèi)膜可見大量深褐色顆粒表達(dá)，融合成片，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達(dá)面積均有不同程度的減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），見圖 4、表 4。

圖4 各組動物主動脈瘦素免疫組化染色結(jié)果（×100）Fig.4 Immunohistochemical staining results of leptin in aorta of each group(×100)

表4 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.4 Expression of aorticand PVAT leptin protein in each group（±s）

表4 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.4 Expression of aorticand PVAT leptin protein in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補(bǔ)腎抗衰片組 6面積比百分?jǐn)?shù)（%）8.1 4±1.5 4 5 4.7 9±2.3 5*1 7.7 5±2.1 5##3 7.5 0±1.0 2#面積2 5 7 4.0 0±1 5 1 1.3 0 4 9 5 4 2.3 3±2 0 3 7.4 7*2 1 5 7 4.3 3±4 2 6 0.9 5##2 4 9 5 9.3 3±2 3 8 6.9 2##

對照組PVAT脂肪細(xì)胞膜可見少量黃色顆粒表達(dá)。與對照組比較，模型組PVAT脂肪細(xì)胞膜可見大量深褐色顆粒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達(dá)面積均有不同程度的減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.01）。見圖5、表 4。

圖5 各組動物血管周圍脂肪組織瘦素免疫組化染色結(jié)果（×100）Fig.5 Immunohistochemical staining results of leptin in PVAT of each group(×100)

2.4.3 MMP-9免疫組化染色結(jié)果 對照組主動脈內(nèi)膜未見明顯褐色顆粒。與對照組比較，模型組增生的內(nèi)膜中可見大量陽性表達(dá)，呈深褐色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥陽性顆粒表達(dá)面積均有不同程度減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（為 P＜0.05），見圖 6、表 5。

圖6 各組動物主動脈MMP-9免疫組化染色結(jié)果（×100）Fig.6 Results of MMP-9 immunohistochemical staining of aorta in each group(×100)

表5 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.5 Expression of MMP-9 protextaand PVAT of each group（±s）

表5 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白表達(dá)情況（±s）Tab.5 Expression of MMP-9 protextaand PVAT of each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補(bǔ)腎抗衰片組 6面積比百分?jǐn)?shù)（%）6.0 7±1.3 3 4 5.4 9±1 1.8 9*2 5.3 0±6.6 5#2 7.7 2±7.0 7#面積2 2 6 4 9.6 7±3 8 4 5.2 6 4 2 4 3 6.0 0±5 2 0 7.2 9*3 2 6 5 5.0 0±3 5 7 1.9 1#3 3 6 6 3.0 0±4 1 0 4.8 4#

對照組PVAT脂肪細(xì)胞膜可見少量黃色顆粒表達(dá)。與對照組比較，模型組PVAT脂肪細(xì)胞膜可見大量深褐色顆粒表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達(dá)面積均有不同程度減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見圖 7、表5。

圖7 各組動物血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白免疫組化染色（×100）Fig.7 Immunohistochemical staining of MMP-9 protein in PVAT tissues of each group(×100)

3 討論

血管周圍脂肪組織一直被認(rèn)為是保護(hù)和支撐血管的一類脂肪組織。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，PVAT是一層貼近血管外膜層的脂肪組織，對AS的形成起雙向作用。在生理?xiàng)l件下，PVAT具有抗炎、維持血管穩(wěn)態(tài)，抑制AS發(fā)生[16]；病理狀態(tài)下，PVAT功能障礙，脂肪細(xì)胞數(shù)量增多、體積增大，功能失調(diào)，細(xì)胞成分和分子特性改變，釋放大量的促炎性因子（如抵抗素、瘦素）、細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6） 和 趨 化 因 子 （RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2），而抗炎性脂肪因子（如脂聯(lián)素）產(chǎn)生減少[17]。本研究觀察了AS模型主動脈及PVAT脂肪細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)的變化，結(jié)果表明，補(bǔ)腎抗衰片可以改善AS模型PVAT巨噬細(xì)胞浸潤情況，并在一定程度上減少脂肪細(xì)胞直徑，提示其具有抑制PVAT炎癥狀態(tài)的作用，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究其對相關(guān)炎癥因子（TNF-α、瘦素、MMP-9）表達(dá)的影響。

TNF-α和瘦素是PVAT分泌的炎性脂肪因子。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分泌大量炎性脂肪因子，而炎性脂肪因子又能夠反過來加劇PVAT組織和血管炎癥，使得PVAT組織和血管炎癥越來越嚴(yán)重[18]。MMP-9是一種主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞的蛋白酶，正常情況下表達(dá)量極少。在AS中，主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），增加血管內(nèi)皮通透性，使脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等更易進(jìn)入血管壁，刺激平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和遷移，VSMC產(chǎn)生和分泌大量ECM，形成纖維帽；隨著AS發(fā)展，MMP-9的表達(dá)明顯增加，降解大量ECM，并影響VSMC凋亡，使斑塊不穩(wěn)定及破裂[19]。本研究觀察了AS模型主動脈及血管周圍脂肪組織瘦素、TNF-α、MMP-9的表達(dá)，結(jié)果表明，補(bǔ)腎抗衰片可以通過抑制TNF-α、瘦素、MMP-9的表達(dá)，對AS模型血管周圍脂肪炎癥起到抑制作用。