南葶藶子清炒前后高效液相指紋圖譜研究*

王 亮，李紅偉

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，鄭州 450001；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046）

葶藶子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、苦，性寒，主癥瘕積聚結(jié)氣、飲食寒熱、破堅逐邪、通利水道[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為有甜、苦兩種，2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定其藥用來源為十字花科植物播娘蒿Desurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl（又稱南葶藶子）和獨行菜Lepidium apetalum Willd.（又稱北葶藶子）的干燥成熟種子，前者稱為甜葶藶，后者稱為苦葶藶[2]。葶藶子的炮制方法以清炒炮制為主，最早見于張仲景《金匱要略》葶藶大棗瀉肺湯中“葶藶熬令黃”[3]，關(guān)于其炮制作用，清代唐宗海認(rèn)為“不炒則不香，不能散，故必炒用”[4]，目前臨床認(rèn)為“炒后藥性緩和，免傷肺氣”[5]。

南葶藶子中主要含有異硫氰酸及其硫苷、黃酮、脂肪油類成分，以及強(qiáng)心苷、三萜、甾醇、香豆素、生物堿、酚酸、揮發(fā)油、氨基酸等成分，對心血管、高血脂等疾病具有顯著功效，所含的成分具有降壓、抗癌、細(xì)胞毒、抗氧化等藥理活性[6]。目前已有南葶藶子指紋圖譜方面的研究報道[7-8]，對其生品和清炒品的指標(biāo)性成分檢測多以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷和芥子堿硫氰酸鹽含量測定為主[9-12]，尚未見南葶藶子清炒品的指紋圖譜研究。因南葶藶子臨床傳統(tǒng)用藥以清炒品為主，因此本研究以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷和芥子堿硫氰酸鹽為對照，分別建立南葶藶子生品和其清炒品的HPLC指紋圖譜，通過相似度評價和對比研究，探討南葶藶子清炒前后指紋圖譜的變化，為實現(xiàn)南葶藶子清炒品生產(chǎn)過程質(zhì)量控制、質(zhì)量信息可追溯提供指紋圖譜參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；KQ-500V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；HX-200型高速中藥粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；ME204萬分之一電子天平（梅特勒·托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試劑和藥品 甲醇為色譜純（批號151282，規(guī)格4 L，純度≥99.9%），乙腈為色譜純（批號156275，規(guī)格4 L，純度≥99.9%），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸二氫鈉分析純（批號20180225，規(guī)格500 g，純度≥99.5%），北京化工廠。南葶藶子樣品采自河南鄭州、安徽亳州、河北安國等地（S1～S12），計12個樣本，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為十字花科（Cruciferae）植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl的干燥成熟種子，見表1。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號PS14012301，規(guī)格 20 mg，純度≥98.0%），芥子堿硫氰酸鹽（批號PS14031803，規(guī)格20 mg，純度≥98.0%），成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱NUCLEODUR C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液，梯度洗脫：0～6min，1%～6%CH3CN；6～24 min，6%～15%CH3CN；24～32 min，15%～20%CH3CN；32～47 min，20%～28%CH3CN；47～52 min，28%～40%CH3CN；52～54 min，40%～40%CH3CN。流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL，色譜分析時間 54 min。

2.2 樣品制備

2.2.1 南葶藶子生品制備 取各批次南葶藶子藥材，去除雜質(zhì)，篩去灰屑，備用（S1～S12）[5]。

2.2.2 南葶藶子清炒品制備 取凈南葶藶子（S1～S12），置預(yù)熱的鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至微鼓起，爆裂聲減弱，并有香氣逸出時，取出，放涼，備用（相對應(yīng)炮制品 P1～P12）[5]。

2.2.3 制備對照品溶液 分別稱取槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、芥子堿硫氰酸鹽1.06、1.62 mg，用60%的甲醇溶解并稀釋，槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為21.2 μg/mL，芥子堿硫氰酸鹽濃度為 162.0 μg/mL，作為對照品溶液。

2.2.4 制備供試品溶液 分別稱取5.0 g南葶藶子生品、清炒品（折合生品質(zhì)量），粉碎過60目篩，置250 mL具塞平底燒瓶中，加蒸餾水170 mL，超聲波400 W，溫度70℃提取30 min，提取液離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至稱量瓶中，于50℃下干燥呈浸膏狀，真空干燥，恒質(zhì)量[13]。精密稱取干燥固體物50.00 mg，用60%甲醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，即為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性實驗 取南葶藶子生品或清炒品供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 5 μL，各主要色譜峰的相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積比值的RSD均小于3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 精密度實驗 取南葶藶子生品或清炒品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，各主要色譜峰的相對保留時間均小于1%，相對峰面積比值的RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。符合指紋圖譜的檢測要求。

2.3.3 重復(fù)性實驗 取同批次飲片6份，分別精密稱定，按“2.3.2”項下方法分別制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣檢測。各主要色譜峰的相對保留時間均小于2%，相對峰面積比值的RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立

2.3.4.1 參照峰的確定 按“2.1”項下的色譜條件，采集“2.3.1”項下所制備的混合對照品溶液色譜圖，峰1為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰（峰標(biāo)號26），峰2為芥子堿硫氰酸鹽峰（峰標(biāo)號30）。見圖1、2。

圖1 混合對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances

圖2 混合對照品（HB）與南葶藶子清炒品（Z1）HPLC疊加指紋圖Fig.2 Overlaying HPLC fingerprint of mixed reference substances（HB）with processed Descurainiae semen（Z1）

2.3.4.2 指紋圖譜的采集 按2.1項下的色譜條件，分別采集12批南葶藶子生品、清炒品指紋圖譜，標(biāo)出其相同的共有峰，結(jié)果見圖3、4。因芥子堿硫氰酸鹽峰相應(yīng)值強(qiáng)，且分離度好，故以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計算其他共有峰的相對峰面積和保留時間，見表 1、2。

2.3.4.3 共有模式的建立 分別將12批南葶藶子生品、清炒品樣品色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版），以S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，經(jīng)多點校正后，中位數(shù)法生成對照圖譜，生品和清炒品對照指紋圖譜見圖4。采用相同方法計算生品和清炒品對照指紋圖譜的相似度，見表3。

表1 12批南葶藶子生品共有峰相對保留時間/相對峰面積Tab.1 Relative retention time/relative peak area of common peaks in 12 batches of crude Descurainiae semen

表2 12批南葶藶子清炒品共有峰相對保留時間/相對峰面積Tab.2 Relative retention time/relative peak area of common peaks in 12 batches of processed Descurainiae semen

2.3.5 相似度評價 分別對南葶藶子、清炒南葶藶子HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度計算，見表4。相似度結(jié)果表明，生品 S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12 樣品間相似度良好，大于0.9，且與對照指紋圖譜相似度均大于0.922。生品S2、S5、S6、S7樣品間相似度良好，大于0.919，但與對照指紋圖譜相似度小于0.9，與其他生品相似度在0.638～0.888之間，這表明這4批生品與其他生品存在一定的差異，這可能與其成長環(huán)境、干燥和貯藏條件等因素有關(guān)。清炒后，P1、P4、P8、P9、P10、P11、P12 樣品間相似度與對照指紋圖譜相似度均大于0.92，相似度相比生品更好；P2、P5、P6、P7 與對照指紋圖譜相似度大于0.953，與其他樣品相似度大于0.894，以上結(jié)果說明，南葶藶子生品間差異較大，大致歸為兩類，樣品S2、S5、S6、S7 為一類，其余樣品為一類。清炒后，樣品之間相似度得到顯著改善，表明建立南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝的必要性，清炒炮制能夠從一定程度上緩解南葶藶子藥間差異，因部分峰面積增大，造成差異減小。這對南葶藶子質(zhì)量控制、藥效一致性研究具有重要意義。

表4 南葶藶子生品和南葶藶子清炒品對照譜相似度Tab.4 Similarities of 12 batches of crude and processed Descurainiae semen

2.3.6 南葶藶子生品與清炒品HPLC指紋圖譜比較 以1號樣品S1和清炒后P1指紋圖譜為例，對比清炒前后差異，見圖5。生品中峰面積大于0.25%的色譜峰有 46 個，其中色譜峰 8、9、13、14、15、23、25、26、30、35、41 為清炒前后共有峰。由圖 3 可看出，清炒后，0～20 min、42～54 min時間段內(nèi)色譜峰峰面積減小，共有峰 No.9、No.13、No.14、No.41 峰面積降低，此段成分多為單糖、寡糖、氨基酸類成分（這些成分在254 nm無響應(yīng)，同時結(jié)合紫外吸收和分子極性確定），結(jié)合清炒炮制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求顏色加深，表明此段成分發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而使得清炒品顏色發(fā)生褐變、加深[14]。20～42 min時間段內(nèi)色譜峰響應(yīng)值增大，其中共有峰No.23、No.26、No.30、No.35峰面積相對生品均升高，非共有峰No.25峰面積升高，清炒工藝對南葶藶子化學(xué)成分有一定影響。

圖3 南葶藶子生品（S1）、清炒品（P1）共有峰HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of crude（S1）and processed（P1）Descurainiae Semen

圖4 12批南葶藶子生品（a）、12批清炒品（b）HPLC疊加指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of 12 batches of crude（a）and processed（b）Descurainiae semen

圖5 南葶藶子生品（RS）和清炒品（RP）對照指紋圖譜Fig.5 Fingerprint common model HPLC of crude（RS）and processed（RP）Descurainiae semen

圖6 12批南葶藶子生品（a）、清炒品（b）及二者比較（c）系統(tǒng)聚類分析圖Fig.6 System clutering analysis chart of 12 batches crude(a)，processed(b)and their compare(c)of Descurainiae semen

2.3.7 系統(tǒng)聚類分析 將12批南葶藶子和清炒南葶藶子作為研究對象，以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計算共有峰相對峰面積，以共有峰相對峰面積為變量，用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，采用離差平方和法，對炮制前后指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，見圖6。結(jié)果表明，從圖6（a）可看出當(dāng)聚合距離為5時，生品葶藶子聚為兩類，其中 S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12 聚為第 1 類，S2、S5、S6、S7 聚為第 2 類，與相似度分析結(jié)果一致，表明建立的指紋圖譜方法可靠。圖6（b）可看出清炒后南葶藶子聚為兩類，除了3號樣品由第1類歸到第2類外，分類結(jié)果與生品一致，該結(jié)果表明，盡管炮制后12批清炒品相似度得到較大改善，但樣品P2、P5、P6、P7與其他樣品仍有差別，該結(jié)果為相似度評價結(jié)果互為補(bǔ)充。從圖6（c）12批南葶藶子生品和其清炒品的聚類分析圖中可看出，當(dāng)聚合距離為10時，南葶藶子12批次清炒品聚為一類，這表明清炒后的南葶藶子和生品有明顯區(qū)別，清炒工藝對南葶藶子的質(zhì)量控制具有顯著作用；生品 S2、S5、S6、S7 聚為一類，其他生品聚類一類，此結(jié)果與圖 6（c）結(jié)果一致，表明生品 S2、S5、S6、S7與其他生品有區(qū)別。

3 討論

本研究首次采用HPLC指紋圖譜比較南葶藶子生品與其清炒品化學(xué)指紋圖譜的差異，結(jié)合相似度評價、系統(tǒng)聚類分析法，不僅能對南葶藶子生品和清炒品進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒別，并且能夠準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)兩者的區(qū)別。所采用的色譜條件重復(fù)性好，易于控制，結(jié)果直觀可靠，方法簡便易行，快速有效，可為南葶藶子生品和清炒品的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

選用水作為提取溶劑，符合南葶藶子臨床用藥的水煎煮的特點，利用超聲提取，避免了南葶藶子水煎煮容易糊鍋的現(xiàn)象，提取工藝采用了超聲水提取優(yōu)化工藝[13]。采用二極管陣列檢測器（DAD）采集190～400nm范圍內(nèi)的響應(yīng)值，通過供試品溶液3D圖譜發(fā)現(xiàn)，在254 nm條件下，色譜峰響應(yīng)值較高，峰形對稱，峰數(shù)較多，分離度較好，基線較為平穩(wěn)，最終選擇254 nm為檢測波長。流動相選擇，結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]，并進(jìn)一步的考察優(yōu)化，選擇了乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液為洗脫流動相，優(yōu)化洗脫程序，基線平穩(wěn)，色譜峰分離度較好，出峰時間較為適中。故確定流動相為乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液。

目前文獻(xiàn)記載南葶藶子的指紋圖譜，存在所得圖譜共有峰數(shù)目少，重復(fù)性差等[8]。本實驗優(yōu)化南葶藶子的高效液相指紋圖譜測定條件，建立南葶藶子清炒品的指紋圖譜。比較南葶藶子生品、清炒品的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，清炒后南葶藶子通過共有模式建立、相似度評價以及HPLC指紋圖譜比較，表明南葶藶子清炒炮制后的HPLC指紋圖譜與生品差異較大，清炒后，0～20 min時間段內(nèi)色譜峰響應(yīng)值減小，20～42 min時間段內(nèi)色譜峰響應(yīng)值增大，如色譜峰槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰（26）、芥子堿硫氰酸鹽峰（30），表明清炒炮制對南葶藶子化學(xué)成分的溶出有一定的影響。生品HPLC指紋圖譜部分批次間差異較大，與其產(chǎn)地來源、加工、干燥、貯藏養(yǎng)護(hù)、包裝等因素有關(guān)，建議盡快建立和完善南葶藶子產(chǎn)地的道地性，產(chǎn)地加工、干燥工藝、貯藏養(yǎng)護(hù)、包裝工藝規(guī)范化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。

對于南葶藶子清炒品和生品的HPLC指紋圖譜研究還存在不足之處，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格按照GMP要求，在控制其產(chǎn)地加工、干燥、貯藏養(yǎng)護(hù)、包裝等條件下，建立其標(biāo)準(zhǔn)化HPLC指紋圖譜或特征圖譜，甚至不同產(chǎn)地的HPLC指紋圖譜或特征圖譜；運用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對南葶藶子清炒炮制前后化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)合多級質(zhì)譜裂解技術(shù)，探討其清炒炮制對其化學(xué)成分的影響，闡明其清炒機(jī)制。