纖溶酶原激活物抑制物-1對(duì)棕櫚酸刺激后小鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制

裴培，成小麗，邢瑞楠，田孝祥，劉丹

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110016

心血管疾病是人類致死致殘的主要原因之一。大量研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在許多心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷及糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-4]。在糖尿病心肌病中，過(guò)量的飽和脂肪酸如棕櫚酸可通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心功能異常及心力衰竭。因此，明確調(diào)控棕櫚酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子及相關(guān)機(jī)制，可為糖尿病心肌病等心血管疾病的防治提供理論依據(jù)和線索。

纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，廣泛表達(dá)于各組織及器官，如心臟、肝臟、肺臟及腎臟[5-7]。PAI-1可抑制纖溶酶原系統(tǒng)，并通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的活化來(lái)抑制膠原及纖維蛋白的清除。因此，PAI-1被認(rèn)為是一個(gè)促纖維化蛋白，在組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織中PAI-1表達(dá)升高與心肌纖維化及心室重構(gòu)密切相關(guān)[9-10]。此外，PAI-1還是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-12]。以上研究均表明，PAI-1在心血管疾病中具有重要作用。然而，PAI-1在糖尿病心肌病及棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究旨在探討PAI-1對(duì)棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原代心肌細(xì)胞提取試劑盒(Thermo公司，美國(guó))，小鼠PAI-1基因小干擾RNA及轉(zhuǎn)染對(duì)照試劑(Santa Cruz公司，美國(guó))，RNA提取試劑盒(Promega公司，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa公司，日本)，PAI-1抗體、β-tublin抗體(Abcam公司，美國(guó))，剪切型的半胱天冬酶3(cleaved-caspase 3)、 BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)抗體、核因子κB(NF-κB)均購(gòu)自美國(guó)CST公司，磷酸化NF-κB(p-NF-κB)抗體(Selleck公司，美國(guó))，NF-κB抑制劑Bay11-7082 (Selleck公司，美國(guó))。

1.2 小鼠原代心肌細(xì)胞的提取及培養(yǎng) 選取出生1～3 d的小鼠乳鼠，采用原代心肌細(xì)胞提取試劑盒進(jìn)行心肌細(xì)胞提取。將心肌細(xì)胞吹散成單細(xì)胞懸液，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng) 狀態(tài)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 ①待小鼠原代心肌細(xì)胞貼壁24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組及棕櫚酸組(400 μmol/L)，刺激24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)PAI-1、cleaved-caspase 3及Bax蛋白的表達(dá)。②建立過(guò)表達(dá)PAI-1及低表達(dá)PAI-1的心肌細(xì)胞：將小鼠PAI-1基因cDNA序列插入到pcDNA3.1(+)載體，構(gòu)建PAI-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。細(xì)胞分為對(duì)照組與PAI-1過(guò)表達(dá)組，在細(xì)胞密度為90%時(shí)，應(yīng)用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。將小鼠PAI-1基因的小干擾RNA分為對(duì)照組與PAI-1低表達(dá)組，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAi max將PAI-1小干擾RNA及轉(zhuǎn)染對(duì)照試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞。檢測(cè)上述各組細(xì)胞PAI-1、cleaved-caspase 3及Bax的表達(dá)水平。③確定PAI-1小干擾RNA轉(zhuǎn)染條件后，給予棕櫚酸刺激24 h后，檢測(cè)PAI-1、cleaved-caspase 3、Bax、p-NF-κB及NF-κB表達(dá)水平。具體分組如下：對(duì)照組、PAI-1低表達(dá)組、棕櫚酸組、PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組。④在PAI-1低表達(dá)的基礎(chǔ)上給予NF-κB抑制劑Bay11-7082預(yù)處理，給予棕櫚酸刺激24 h后，檢測(cè)p-NF-κB及NF-κB的表達(dá)水平。具體分組如下：棕櫚酸組、PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組、Bay11-7082 +棕櫚酸組、PAI-1低表達(dá)+Bay11-7082+棕櫚酸組。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)PAI-1基因mRNA表達(dá) 采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)500 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用SYBR Green方法對(duì)cDNA行熒光定量PCR擴(kuò)增PAI-1及內(nèi)參照GAPDH。引物序列：PAI-1， 正向5'-CA AGCTCTTCCAG A TATGGTG-3'，反向5'-ACCTTTG GTATG CCTTTCC AC-3'；GAPDH，正向5'-CCAGGCGCCCAATACG-3'，反向5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'。結(jié)果以Ct值表示，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blotting檢測(cè)PAI-1、cleaved-caspase 3、Bax及p-NF-κB蛋白的表達(dá)水平 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。以SDSPAGE膠對(duì)蛋白(30 μg)進(jìn)行電泳。一抗采用抗PAI-1抗體、cleaved-caspase 3抗體、Bax抗體、p-NF-κB及NF-κB抗體，二抗使用HRP標(biāo)記的抗體，以β-tublin為內(nèi)參照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 棕櫚酸刺激對(duì)心肌細(xì)胞凋亡蛋白及PAI-1表達(dá)的影響 棕櫚酸組的cleaved-caspase 3、Bax及PAI-1蛋白表達(dá)水平(灰度值分別為4912.42±383.71、2942.63±440.07、3725.12±419.13)均明顯高于對(duì)照組(灰度值分別為390.91±59.50、990.21±174.53、1973.51±371.82)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01， 圖1)。

圖1 Western blotting檢測(cè)棕櫚酸刺激心肌細(xì)胞24 h后凋亡蛋白及PAI-1蛋白的表達(dá)Fig.1 Expressions of apoptotic protein and PAI-1 in cardiomyocytes 24 h after palmitate stimulation (Western blotting)

2.2 過(guò)表達(dá)PA I-1 及低表達(dá)PA I-1 心肌細(xì)胞模型的建立 PA I-1過(guò)表達(dá)組的PA I-1 mR NA(Ct值為2 0.4 2±0.2 0)及蛋白表達(dá)水平(灰度值為6641.37±163.11)均明顯高于其對(duì)照組(Ct值為21.77±0.38，灰度值為2681.14±153.85)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)。同時(shí)，PAI-1低表達(dá)組的PAI-1 mRNA(Ct值為24.12±0.88)及蛋白表達(dá)水平(灰度值為752.04±94.95)均明顯低于其對(duì)照組(Ct值為23.10±0.46，灰度值為2916.96±91.74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 過(guò)表達(dá)PAI-1及低表達(dá)PAI-1心肌細(xì)胞模型的建立Fig.2 Establishment of cardiomyocyte models with PAI-1 low expression and PAI-1 over expression

2.3 PAI-1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3及Bax表達(dá)的影響 與相應(yīng)對(duì)照組(灰度值分別為3826.05±282.99、3084.98±332.20)比較，PAI-1低表達(dá)組及過(guò)表達(dá)組cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(灰度值分別為3388.04±527.29、3036.08±121.37，P>0.05)；與相應(yīng)對(duì)照組比較(灰度值分別為5251.56±147.65、5501.67±360.17)，PAI-1低表達(dá)組及過(guò)表達(dá)組Bax蛋白表達(dá)水平(灰度值分別為5412.62±172.24、5640.58±149.82)也無(wú)明顯變化(P>0.05，圖3A)。

與對(duì)照組(灰度值分別為2312.43±225.36、2 5 3 6.6 4±4 9 0.2 2)相比，P A I-1 低表達(dá)組cleaved-caspase 3及Bax蛋白表達(dá)(灰度值分別為2295.33±162.84、2563.03±217.80)和PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組cleaved-caspase3及Bax蛋白表達(dá)(灰度值分別為2384.41±269.31、2741.56±373.87)無(wú)明顯變化(P>0.05)，而棕櫚酸組cleaved-caspase 3及Bax蛋白表達(dá)(灰度值分別為6235.98±482.49、6998.4±162.87)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3B)；與PAI-1低表達(dá)組相比，棕櫚酸組cleaved-caspase 3及Bax蛋白水平明顯升高(P<0.01)，而PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組無(wú)明顯變化(P>0.05)；與棕櫚酸組相比，PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組cleaved-caspase 3及Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。

2.4 PAI-1對(duì)棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞p-NF-κB表達(dá)的影響 與對(duì)照組(灰度值為3473.03±436.06)相比，PAI-1低表達(dá)組及PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組p-NF-κB表達(dá)(灰度值分別為3523.33±360.36、3826.64±461.61)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而棕櫚酸組p-N F-κ B 蛋白表達(dá)水平(灰度值為9035.07±526.88)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與PAI-1低表達(dá)組相比，棕櫚酸組p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組的p-NF-κB蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化；與棕櫚酸組相比，PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組p-NF-κB表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

圖4 PAI-1對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PAI-1 on the expression of phosphorylated NF-κB protien in cardiomyocytes after palmitate stimulation

2.5 NF-κB抑制劑Bay11-7082對(duì)棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 與棕櫚酸組(灰度值分別為9838.07±1025.45、9735.50±1088.19)相比，PA I-1 低表達(dá)+棕櫚酸組(灰度值分別為3169.20±163.68、4732.07±181.28)、Bay11-7082+ 棕櫚酸組(灰度值分別為3 2 1 8.7 7±2 4 9.1 7、4838.87±283.33)、PAI-1低表達(dá)+Bay11-7082+棕櫚酸組(灰度值分別為4 3 5.2 0±9 9.8 7、1275.63±226.74)cleaved-caspase 3及Bax表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與PAI-1低表達(dá)+棕櫚酸組相比，Bay11-7082+棕櫚酸組cleavedcaspase 3及Bax表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而PAI-1低表達(dá)+Bay11-7082+棕櫚酸組cleaved-caspase 3及Bax表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Bay11-7082+棕櫚酸組相比，PAI-1低表達(dá)+Bay11-7082+棕櫚酸組cleavedcaspase 3及Bax表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Bay11-7082對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Bay11-7082 on the expression of apoptotic protein in cardiomyocytes after palmitate stimulation

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡是許多心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[13]，包括心肌梗死、心力衰竭及糖尿病心肌病 等[14-15]。越來(lái)越多的研究關(guān)注心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病中的作用[16-17]，但影響糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的分子及其機(jī)制仍有待闡明[18]。

本研究采用棕櫚酸刺激小鼠原代心肌細(xì)胞來(lái)建立糖尿病心肌病的細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，同時(shí)PAI-1表達(dá)也明顯增加，提示PAI-1與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。為進(jìn)一步明確PAI-1在棕櫚酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用，本研究分別建立PAI-1過(guò)表達(dá)及低表達(dá)的心肌心肌細(xì)胞模型，檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常生理情況下PAI-1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡無(wú)影響，在PAI-1低表達(dá)基礎(chǔ)上給予棕櫚酸刺激，心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)明顯下降，提示低表達(dá)PAI-1可抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

研究表明，NF-κB通路在維持正常心肌細(xì)胞生存及心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸刺激后心肌細(xì)胞中p-NF-κB表達(dá)明顯升高，而PAI-1低表達(dá)后可抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的p-NF-κB表達(dá)升高，且上述作用可被NF-κB抑制劑Bay11-7082抑制，說(shuō)明PAI-1可通過(guò)NF-κB通路參與棕櫚酸對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。但PAI-1與NF-κB之間的直接調(diào)控分子及PAI-1的上游調(diào)控分子尚不 清楚。

miRNA是一類序列保守的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[22-23]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，PAI-1可作為miR-143的直接下游靶基因影響骨肉瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲，同時(shí)還可作為miR-335-5p的靶基因參與下肢深靜脈血栓的發(fā)生[24-25]。但PAI-1是否受到一個(gè)或多個(gè)miRNA的調(diào)控從而參與棕櫚酸對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響目前尚不明確。本研究主要在細(xì)胞水平模擬糖尿病心肌病模型，研究PAI-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，與疾病模型還存在一定差異。為深入探討在糖尿病心肌病狀態(tài)下PAI-1的作用，下一步工作將集中在動(dòng)物模型水平，采用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素的方法建立糖尿病心肌病動(dòng)物模型，明確PAI-1表達(dá)變化與糖尿病心肌病的關(guān)系，并通過(guò)構(gòu)建PAI-1相關(guān)腺病毒，在體研究PAI-1對(duì)糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的 影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，棕櫚酸可導(dǎo)致心肌細(xì)胞中PAI-1及凋亡蛋白表達(dá)增加，低表達(dá)PAI-1可通過(guò)調(diào)控NF-κB通路抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。