藜蘆甾體生物堿抗腫瘤活性研究進(jìn)展＊

李文希，張 屏，李福全，張 烜，岳 鑫，包保全＊＊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 呼和浩特 010110；3.呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院 呼倫貝爾 021000）

蒙藥“阿格希日嘎”，中文名藜蘆，為百合科植物藜蘆Veratrum nigrum L.的干燥根及根莖，味苦、辛，性平，有毒，具有瀉下、催吐之功效，用于治療“希拉”病、消化不良、鐵垢巴達(dá)干，痞癥等[1]。本品來(lái)源于內(nèi)蒙古野生藜蘆屬植物藜蘆V.nigrum，主產(chǎn)于呼倫貝爾盟、哲里木盟、赤峰、錫林郭勒盟和烏蘭察布盟；其它兩種藜蘆，毛穗藜蘆V.maackii，主產(chǎn)呼倫貝爾盟（鄂倫春自治旗大楊樹(shù)），興安藜蘆V.dahuricum，主產(chǎn)于大興安嶺（白狼、克一河、寶格達(dá)山），也作為蒙藥藜蘆同等入藥[2]。藜蘆為蒙醫(yī)寒熱證總瀉藥，其中瀉痞為其主要功效之一。根據(jù)蒙醫(yī)傳統(tǒng)理論，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床診斷的很多腫瘤和癌癥都屬于蒙醫(yī)所界定的痞塊癥。本文對(duì)蒙醫(yī)藥古文獻(xiàn)中以藜蘆為主藥的方劑進(jìn)行了整理，共收集36個(gè)方劑，包括劑型、功效主治、組方及出處信息，它們均具有清瀉體內(nèi)邪氣和病理產(chǎn)物之功效，其中用于瀉痞的方劑有8個(gè)。該研究為蒙藥藜蘆治療腫瘤及抗腫瘤制劑的開(kāi)發(fā)提供文獻(xiàn)依據(jù)。

藜蘆屬（Veratrum）為百合科（Liliaceae）植物，全世界約有四十種，分布于亞洲、歐洲和北美洲，《中國(guó)植物志》載有13種1變種，廣泛作為藥用[3]。本屬植物的化學(xué)成分包括甾體生物堿類、二苯乙烯類、黃酮類、二肽類及其它，其中甾體生物堿為主要藥效活性成分，具有顯著的生理效應(yīng)，例如抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)心肌收縮力、降血壓等[4]。目前，已分離得到甾體生物堿70余種，其結(jié)構(gòu)分類、藥理作用及藥理毒理研究已有綜述報(bào)道[5-7]。本文總結(jié)了近10年來(lái)分離得到的新異甾體生物堿，及在化合物單體層面的抗腫瘤活性研究，包括在細(xì)胞水平上的抗腫瘤活性篩選、化合物結(jié)構(gòu)修飾、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制等，為藜蘆及其制劑抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制、新藥研發(fā)提供參考。

1 藜蘆（阿格希日嘎）蒙醫(yī)方劑總結(jié)

蒙藥藜蘆為寒熱癥總瀉藥[8]，在蒙醫(yī)臨床中用于瀉下、脈瀉、鼻瀉、導(dǎo)瀉和催吐療法，治療“希拉”病、消化不良、痞塊、鐵垢巴達(dá)干，劍突痞，痧癥，蟲(chóng)癥，疫熱，胎衣不下，水腫，瘡疽等。蒙醫(yī)理論認(rèn)為，痞塊癥系人體某部位，由惡血、黃水等聚集凝結(jié)而形成之痞塊的總稱，多屬于繼發(fā)各種病患的郁結(jié)性痼疾，可發(fā)生于人體各器官，包括食痞、血痞、赫依性痞塊、希拉性痞塊、膿痞和水痞等[9]。目前，蒙醫(yī)臨床用于治療痞塊癥（包括各種腫瘤和癌癥）的藥物主要為“破痞去滯”和“瀉痞”類蒙藥，且臨床療效明顯。本文從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥博物館“蒙醫(yī)藥古文文獻(xiàn)全文檢索數(shù)據(jù)庫(kù)”中收集到以藜蘆為主藥的蒙藥瀉下方劑36個(gè)，對(duì)其劑型、功效主治、組方及出處信息列于表1。其中明確用于瀉痞的方劑有8個(gè)，列于表格第一部分，包括阿格希日嘎-4（清希拉、瀉痞）、肝病緩瀉劑（瀉肝熱、肝硬化）、巴達(dá)干瀉劑（瀉巴達(dá)干腫塊）、阿格希日嘎-3（瀉包如病積聚引起的痞塊）、瀉痞劑（破痞、瀉下）、抑黏紅丸（血瘀、痞證）、斑蝥七味丸（脈瀉、破痞）、斑蝥九味丸（脈瀉、破痞）。表格中還收集了瀉“希拉”、清熱方劑7個(gè)；殺黏、清瘟、瀉毒方劑10個(gè)，其它瀉肝熱、“赫依”、包如等10個(gè)；催吐方劑1個(gè)。這些方劑的整理為蒙藥藜蘆的瀉下應(yīng)用，尤其是“瀉痞”作用提供了依據(jù)，極有可能從中找到抗腫瘤活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)出新型蒙藥抗癌制劑。

表1 蒙醫(yī)藥古文文獻(xiàn)中藜蘆（阿格希日嘎）的方劑總結(jié)

續(xù)表1

2 藜蘆甾體生物堿化學(xué)成分研究進(jìn)展

藜蘆屬植物中甾體生物堿種類非常豐富，其基本骨架由27個(gè)碳組成，甾體部位可分為膽甾烷型和異膽甾烷型兩類，膽甾烷型生物堿又可分為茄次堿型（solanidine type）和維藜蘆堿型（verazine type），異膽甾烷型又可分為西藜蘆堿型（cevine type）和介藜蘆胺型（jervine type）[10]，其結(jié)構(gòu)母核見(jiàn)圖1。

從藜蘆屬植物中分離得到的甾體生物堿有70余種[6]，近年又從中分離得到13種新的甾體生物堿。Yue Cong[11]等，2008年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.中分離得到1種新的生物堿，命名為12-βhydroxylveratroylzygadenine(1)。Veselin Christov[12]等，2010年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.中分離得到1種新的生物堿，命名為(±)-15-O-(2-Methylbutyroyl)germine(2)。William Jia等[13]，2010年從黑藜蘆Vertrum nigrum L.根及根莖分離得到2種新的生物堿，分別命名為neoverapatuline(3)和(1β,3α,5β)-1,3-dihydroxyjervanin-12-en-11-one(4)。Yun Sun等[14]，2012年從大理藜蘆Veratrum taliense中分離得到3種新的生物堿，分別命名 為3-O-acetylveralkamine(5)、veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)(6)和6,7-epoxyverdine(8)。湯建等[15]，2008年從興安藜蘆Veratrum dahuricum的根及根莖中分離、鑒定了甾體生物堿26個(gè)，包括5種新的甾體生物堿，分別命名為14α-羥基-△11-環(huán)杷明(9)、3-乙酰基-15-當(dāng)歸?；?jì)明堿(10)、3，7-二乙?；?15-當(dāng)歸酰基計(jì)明堿(11)、3-藜蘆?；?jì)明堿(12)、3-藜蘆?；?15-當(dāng)歸?；?jì)明堿(13)。

3 藜蘆甾體生物堿抗癌活性研究進(jìn)展

圖1 藜蘆屬中甾體生物堿的基本骨架類型

Yun Sun等[13]，2010年從大理藜蘆Veratrum taliense中分離得到的8種甾體生物堿，采用MTT法進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，新化合物3-Oacetylveralkamine（5）對(duì)所測(cè)試的五種人腫瘤細(xì)胞系，即HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7和SW480均有顯著的抑制作用，IC50值分別為10.02,17.05,16.51,6.40和5.61μmol·L-1。新 化 合 物veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)（6）和已知化合物藜蘆卡明（7）對(duì)除SMMC-7721以外的四種腫瘤細(xì)胞系有顯著抑制作用，IC50值 分 別 為4.07、21.01、13.48、19.04μmol·L-1和10.60、19.08、8.29、11.53μmol·L-1。

Jian Tang等[16-17]，2008-2010年間，從興安藜蘆Veratrum dahuricum根莖中分離得到總生物堿及甾體生物堿類化合物，對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性檢測(cè)，結(jié)果表明藜蘆總生物堿對(duì)A-549、PANC-1、SW1990和NCI-H249這4種腫瘤細(xì)胞系均有一定的抑制活性，并且后續(xù)分析表明，介芬胺類生物堿占總生物堿總含量的60-65%，進(jìn)而推測(cè)介芬胺類生物堿很可能是藜蘆提取物抗腫瘤活性的活性成分。介芬胺類化合物環(huán)杷明（14）對(duì)PANC-1、SW1990和NCI-H249三種癌細(xì)胞株均有顯著的抑制作用，其中對(duì)NCI-H249的抑制作用最強(qiáng)(IC50=14.4μmol·L-1）。同時(shí)環(huán)杷明對(duì)腫瘤細(xì)胞株A-549、LOVO和QGY-7703也表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，其IC50值分別為：38.36、40.16、88.36μg·mL-1。藜蘆胺（16）顯示出與環(huán)巴胺類似的細(xì)胞毒性，并且對(duì)人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549、Aspc-1、PANC-1、SW1990、NCIH249、LOVO、QGY-7703和6T-CEM均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，其IC50值分別為8.9、79.6、14.5、26.1、23.23、35.35、15.32μmol·L-1。但介芬胺的葡萄糖苷偽介芬胺（26）和藜蘆胺的葡萄糖苷藜蘆托素（17），對(duì)這四種腫瘤細(xì)胞系的IC50值均大于100μg·mL-1；西藜蘆堿類化合物中除15-當(dāng)歸?；?jì)明堿（21）對(duì)6T-CEM瘤株有中等抑制作用（IC50=38.74μg·mL-1）外，3,15-二當(dāng)歸?；?jì)明堿（22）、當(dāng)歸?；灞P(pán)花胺（23）、藜蘆?；灞P(pán)花胺（24）、計(jì)明堿（25）對(duì)四種腫瘤細(xì)胞系均無(wú)顯著細(xì)胞毒活性。計(jì)明堿（25）對(duì)SW1990和NCI-H249細(xì)胞系比較敏感，其IC50值分別為47.2和24.1μmol·L-1，而對(duì)A549和PANC-1細(xì)胞系無(wú)明顯的抑制作用，這是首次發(fā)現(xiàn)西藜蘆堿類生物堿能夠選擇性抑Hh信號(hào)通路依賴性細(xì)胞SW1990和NCI-H249，需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)計(jì)明堿的抑制活性。

Yue Cong[13]等，2010年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.的根及根莖中分離得到一種新的生物堿和四種已知生物堿類化合物，其中新的生物堿12β hydroxylveratroylzygadenine（1）和已知生物堿介芬胺（17）、藜蘆酰棋盤(pán)花堿（30）對(duì)人HL-60細(xì)胞系均具有顯著的抑制效果，其IC50值為52.67、52.90、56.51μmol·L-1。

4 藜蘆甾體生物堿構(gòu)效關(guān)系及微生物代謝研究

郭修晗等[18]，2015年以藜蘆胺（16）為原料，通過(guò)在藜蘆胺的哌啶環(huán)相應(yīng)位置引入修飾基團(tuán)的方法，增加構(gòu)象限制，設(shè)計(jì)合成三種藜蘆胺類衍生物（18）、（19）、（20）。采用MTT法對(duì)所得到的化合物對(duì)于人胰腺癌ASPC-1細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。相應(yīng)產(chǎn)物（18）、（19）、（20）具有同對(duì)照品環(huán)巴胺相似或略強(qiáng)的活性，化合物（18）和（19）對(duì)ASPC-1的活性明顯優(yōu)于原料藜蘆胺及對(duì)照品環(huán)巴胺，化合物（19）在對(duì)人胰腺癌ASPC-1細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50分別為18.8μmol·L-1和38.2μmol·L-1。初步構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明，在藜蘆胺的哌啶環(huán)上引入煙酸及對(duì)硝基苯甲?；鶊F(tuán)等修飾基團(tuán)可顯著提高藜蘆胺F環(huán)的抗腫瘤活性，環(huán)巴胺是一種選擇性抑制Hedgehog信號(hào)通路的甾體生物堿，具有顯著的抗腫瘤活性，介芬胺為環(huán)巴胺的11氧代衍生物在藜蘆中含量較高。兩者雖然結(jié)構(gòu)相似，但介芬胺的抗腫瘤活性明顯弱于環(huán)巴胺[19]。2015年，鄭曉紅等[19]為研究環(huán)巴胺類似物抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系，以介芬胺為原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，采用選擇性還原、甲基化及氧化反應(yīng)合成了環(huán)巴胺及8個(gè)類似物。運(yùn)用MS、NMR對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，以MTT法研究產(chǎn)物對(duì)人胰腺癌ASPC-1和人胃癌SGC-7901細(xì)胞體外增殖的抑制作用，結(jié)果表明介芬胺的三種還原產(chǎn)物中只有環(huán)巴胺顯示了良好的抑制活性，而其它兩個(gè)還原產(chǎn)物的抑制活性與介芬胺類似，說(shuō)明11位的取代基與化合物的抗腫瘤活性密切相關(guān)，當(dāng)11位為亞甲基時(shí)抗腫瘤活性較強(qiáng)，羥基和羰基均降低活性。此外，在氧化產(chǎn)物和甲基化產(chǎn)物中，只有化合物(32)對(duì)ASPC-1和SGC-7901兩種細(xì)胞均具有較好的抑制活性，其IC50分別達(dá)到66.68和66.31μmol·L-1，表明3位羥基的氧化可能會(huì)增強(qiáng)化合物的抗癌活性。

圖2 藜蘆屬中甾體生物堿的代表性化學(xué)結(jié)構(gòu)

Mohammed A.Khanfar[20]對(duì)異甾體類生物堿對(duì)人轉(zhuǎn)移性前列腺癌PC-3細(xì)胞系的增殖和遷移的能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，C-3β-糖苷化（26）以及5α-△5,6（20）還原后對(duì)PC-3細(xì)胞系的細(xì)胞毒性降低。藜蘆胺（16）的微生物代謝物（30）在10μmol·L-1濃度下顯示出良好的抗增殖活性，表明藜蘆醚通過(guò)C-3氧化成酮后活性增強(qiáng)，與△5,6遷移至△4,5有關(guān)，這種化學(xué)修飾可以彌補(bǔ)E環(huán)開(kāi)放造成的活性損失。在傷口愈合測(cè)定中發(fā)現(xiàn)偽介芬胺和二氫介芬胺的抗遷移活性不好，表明C-3β-糖苷化或△5,6還原會(huì)對(duì)抗遷移活性產(chǎn)生不利的影響，具有△1,2和△4,5的C-3氧化成酮的藜蘆胺微生物代謝產(chǎn)物（31）顯示出對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞系最有效的抗遷移活性。表明甾體生物堿的藥理活性與其母核結(jié)構(gòu)和取代基之間存在著密切的關(guān)系。

5 藜蘆甾體生物堿的抗癌機(jī)制研究

5.1 Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑

現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，環(huán)巴胺在脊椎動(dòng)物中抗腫瘤作用與Shh基因介導(dǎo)的hedgehog信號(hào)通路有關(guān)，當(dāng)該通路過(guò)度激活時(shí)會(huì)影響腫瘤的形成過(guò)程[21]。張萍萍[22]等人利用劃痕試驗(yàn)表明，環(huán)巴胺可顯著降低HEC-1A細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05），同時(shí)也反映出環(huán)巴胺可削弱人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。1980年，Hedgehog基因由Nusslein-Vollhard和Wieschaus在研究果蠅的基因突變時(shí)發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)對(duì)腫瘤的形成和生長(zhǎng)具有重要作用，細(xì)胞特異性的組織增生主要由Hh基因在不同組織中的過(guò)度表達(dá)和靶基因突變導(dǎo)致，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23]。

5.2 Caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡

丁婧[24]等研究結(jié)果表明，環(huán)巴胺體外給藥能促進(jìn)AIA軟骨細(xì)胞的增殖，并抑制AIA軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡，該抗凋亡作用和提高Bcl-2 mRNA表達(dá)，并降低Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)密切相關(guān)。Caspases（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）是半胱氨酸蛋白酶家族，在啟動(dòng)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡（程序性細(xì)胞死亡）中發(fā)揮重要作用[25]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是caspase家族的一員，是細(xì)胞凋亡的主要下游介質(zhì)，被認(rèn)為是caspase的主要執(zhí)行者[26]。作為各條凋亡通路作用的樞紐、細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者的Caspase-3，可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體，而抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細(xì)胞凋亡受抑制[27]。

5.3 細(xì)胞周期

孫全武[28]等研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路阻斷劑環(huán)巴胺對(duì)DU145細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)DU145細(xì)胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺可以抑制DU145細(xì)胞的增殖能力，其機(jī)制可能與下調(diào)DU145細(xì)胞cyclin E mRNA表達(dá)水平，從而將DU145細(xì)胞阻滯于G1期有關(guān)。張萍萍[22]等利用對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了環(huán)巴胺具有可阻滯HEC-1A細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，使其停滯于G0∕G1期，從而抑制HEC-1A細(xì)胞增殖的作用。人們通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)由兩類蛋白家族構(gòu)成，一類被稱為周期素（Cycin），已發(fā)現(xiàn)的周期素有CycinA、B、C、D、E等，它們分別作用于細(xì)胞周期的不同階段。另一類稱為細(xì)胞周期素依賴激酶（cyclindependentkinase，CDK），細(xì)胞通過(guò)對(duì)CDK的正負(fù)調(diào)控作用來(lái)維持自身增殖分裂的平衡，其中P21、P27、P16等能使CDK失活，為其負(fù)調(diào)節(jié)子，而細(xì)胞周期素能激活CDK，是CDK的正調(diào)節(jié)子。

5.4 自噬

李雪等人[22]通過(guò)利用流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示：HEC-1A細(xì)胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后，表達(dá)LC3B蛋白HEC-1A細(xì)胞的百分比明顯提高（P＜0.05），同時(shí)，細(xì)胞中的LC3B蛋白水平也顯著上升（P＜0.05），表明了HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬可由環(huán)巴胺誘導(dǎo)，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)與存活。作為細(xì)胞保存生命活動(dòng)動(dòng)態(tài)平衡的重要途徑的細(xì)胞自噬過(guò)程，其主要包括細(xì)胞內(nèi)蛋白及細(xì)胞器的降解循環(huán)。根據(jù)已有研究結(jié)果證實(shí)，腫瘤發(fā)生與自噬失調(diào)存在明顯相關(guān)關(guān)系，通過(guò)利用引發(fā)自噬，腫瘤細(xì)胞可應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境，并維持、調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或引發(fā)細(xì)胞凋亡[29]。

6 結(jié)論與展望

藜蘆屬植物品種多樣、分布廣泛、多做藥用，其中蒙藥藜蘆瀉痞療效確切，應(yīng)用歷史悠久，為現(xiàn)代抗腫瘤制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。中藥藜蘆與蒙藥藜蘆在資源分布、功效主治、服用原則與配伍規(guī)律等方面有明顯差異，前期研究表明兩者在化學(xué)成分特征圖譜上差異顯著。特別是具有活性且有毒的甾體生物堿類成分，蒙藥藜蘆幾乎不含有中藥藜蘆的主要甾體生物堿成分，介芬胺和藜蘆胺[30]。近年來(lái)，不斷從藜蘆屬植物中分離得到新型的甾體生物堿，該類成分的抗腫瘤活性及作用機(jī)制日益得到闡明，其結(jié)構(gòu)修飾的研究也開(kāi)始起步，為藜蘆及其制劑抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制、新藥研發(fā)提供了一定的參考。然而，藜蘆甾體生物堿作為抗腫瘤藥物的使用也存在一些問(wèn)題亟待解決。第一，該屬植物的介藜蘆胺類和西藜蘆堿類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗腫瘤活性，但茄次堿型及維藜蘆堿型化合物的抗腫瘤活性研究比較少見(jiàn)。第二，甾體生物堿的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而到目前為止有關(guān)構(gòu)效關(guān)系的研究較少。第三，目前對(duì)典型甾體生物堿的作用機(jī)制研究較多，很多甾體生物堿的作用機(jī)制仍未被闡明，可以結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)深入研究其活性機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系。此外，可以結(jié)合蒙藥方劑學(xué)開(kāi)發(fā)出藥物新劑型。因此，蒙藥藜蘆具有極高的研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力，對(duì)其進(jìn)行更深入的研究和探索，具有廣泛而深遠(yuǎn)的意義。