乳香與醋乳香對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠抗炎作用的對(duì)比研究＊

梁東蕊，宋志前，寧張弛，王 淳，馬新玲，萬(wàn)曉瑩，劉振麗

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所 北京 100700）

乳香來(lái)源于橄欖科植物乳香樹(shù)Boswellia carterii Birdw.及同屬植物Boswellia bhaw-dajiana Birdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂，主治胃脘疼痛，癥瘕腹痛，癰腫瘡瘍[1-2]。始載于《名醫(yī)別錄》，具有活血行氣化瘀、消腫止痛的功效[2]。國(guó)外臨床研究顯示，乳香醇制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）有很好的療效，80%患者服用后病情得到緩解[3]，其對(duì)慢性結(jié)腸炎II級(jí)和III級(jí)患者有效率分別為100%和60%[4]。UC是炎癥性腸炎（Inflammatory bowel disease，IBD）的一種，病變范圍廣泛[5]。中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“腸澼”、“泄瀉”及“痢疾”等范疇，采用“清熱利濕、化瘀行氣、澀腸解毒”為主要治法[6]。認(rèn)為針對(duì)其“氣滯血瘀而發(fā)病”的特點(diǎn)，可以運(yùn)用乳香活血行氣的功效加以治療[7]。中醫(yī)臨床治療多以其炮制品醋乳香入藥[8-9]。乳香醋炙可降低刺激性，并增強(qiáng)活血行氣化瘀、消腫止痛功效[1]。由角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸腔白細(xì)胞游走抑制實(shí)驗(yàn)也表明，乳香醋炙后抗炎作用顯著增強(qiáng)[10]。那么，醋乳香對(duì)UC模型動(dòng)物是否有作用，以及醋炙前后作用是否存在差異，還未見(jiàn)研究報(bào)道。

UC常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作方法主要有化學(xué)刺激法、免疫法和復(fù)合法三大類。TNBS∕乙醇作為常用的復(fù)合法，制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且具有較好的重復(fù)性，通過(guò)單劑灌腸誘導(dǎo)，不需要預(yù)先致敏或?qū)?dòng)物進(jìn)行外科手術(shù)，模型持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，模型組織學(xué)變化與人類結(jié)腸炎相似，是評(píng)價(jià)藥物療效穩(wěn)定的結(jié)腸炎模型[11]。因此本文擬采用TNBS∕乙醇誘導(dǎo)大鼠UC模型，通過(guò)比較大鼠的DAI、CMDI、結(jié)腸HS評(píng)分以及腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）的水平，探究醋乳香對(duì)UC功效及醋炙前后的作用差異，為乳香醋炙理論提供科學(xué)基礎(chǔ)，并為臨床提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重（250±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)SYXK（京）2016-0021]。

1.2 飲片、藥品及試劑

乳香購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，均為橄欖科植物乳香樹(shù)Boswellia carterii Birdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂。TNBS(批號(hào)SP229701，Sigma），水合氯醛（批號(hào)20180420，天津福晨化學(xué)試劑廠），柳氮磺吡啶腸溶片（Salazosulfapyridine，SASP）（0.25 g∕片，批號(hào)20180106，上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），羧甲基纖維素鈉（Sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na，批 號(hào)20161025，上海滬試），0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)1709283205，石家莊四藥有限公司），95%乙醇（批號(hào)20160504，北京化工廠），甲醛溶液（批號(hào)20180420，天津福晨化學(xué)試劑有限公司），注射器（批號(hào)20130821，山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司），血清管（批號(hào)180601，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司），細(xì)胞因 子TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試 劑 盒（批 號(hào)20180830、20180830、20180830，北京四正柏公司）。

1.3 儀器

CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；HSS-1 B數(shù)字式超級(jí)恒溫浴槽（成都儀器廠）；低溫離心機(jī)（美國(guó)西格瑪公司）；Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；CKX41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；石蠟包埋機(jī)（中國(guó)湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）；手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Slfe）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物配制

2.1.1 陽(yáng)性對(duì)照藥柳氮磺吡啶混懸液的配制

將柳氮磺吡啶片粉碎，過(guò)100-120目篩。稱取337.5 g粉末，以6750 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液配制為混懸液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按柳氮磺吡?0 mg∕100 g大鼠體重給藥。

2.1.2 乳香、醋乳香混懸液的配制

首先炮制醋乳香。按照2015版中國(guó)藥典[1]和前期研究結(jié)果[2]，稱取乳香適量，采用中火（設(shè)定電磁爐溫度130℃），待鍋底溫度達(dá)到130℃后投入乳香，不斷翻炒，炒制9 min后，按照10∶1的比例噴入陳放2年以上的米醋，繼續(xù)翻炒2 min出鍋，攤開(kāi)晾涼，得到醋乳香。

分別稱取乳香和醋乳香適量，在相同條件下粉碎，過(guò)100目篩，即得到乳香及醋乳香粉末。以70 kg人體用藥量作為等劑量，制成含乳香或醋乳香的0.5%CMC-Na混懸液，用時(shí)搖勻，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 UC模型建立及分組處理

2.2.1 造模方法[12]

采用SD雄性大鼠，體重280-300 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，禁食不禁水36 h后，按照完全隨機(jī)法，正常組10只，造模動(dòng)物84只，分別給予2%戊巴比妥鈉（45 mg·kg-1）腹腔麻醉，用直徑2 mm的橡膠輸液管緩慢推入距大鼠肛門(mén)約8 cm深的腸腔內(nèi)。造模動(dòng)物一次性將5%TNBS（100 mg·kg-1）水溶液和50%乙醇溶液的1:1混合液注入大鼠肛門(mén)，捏緊倒置保留5 min。正常組按同樣方法，以同體積0.9%氯化鈉溶液注入大鼠肛門(mén)。讓動(dòng)物保持平衡狀態(tài)，均自然清醒后正常喂養(yǎng)。

2.2.2 分組及給藥

除了上述正常對(duì)照組（A），將造模動(dòng)物分為6組，即模型對(duì)照組（B）、乳香等劑量組（C，0.45 g·kg-1）、乳香2倍劑量組（D，0.90 g·kg-1）、醋乳香等劑量組（E，0.45 g·kg-1），醋乳香2倍劑量組（F，0.90 g·kg-1），陽(yáng)性對(duì)照組（G，0.50 g·kg-1），每組10只。造模后第二天開(kāi)始給藥。給藥組按上述劑量分別灌胃給藥，正常組按10 mL∕kg劑量給予CMC-Na。每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）的觀測(cè)[13-14]

造模成功后，每周稱量大鼠體重并觀察糞便情況。按表1評(píng)估大鼠DAI，DAI=（體重+大便形態(tài)+大便出血）∕3。

2.3.2 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）的觀測(cè)[13-14]

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL∕100 g）進(jìn)行麻醉后，將其固定于手術(shù)臺(tái)。剝離結(jié)腸組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察結(jié)腸粘膜損失指數(shù)評(píng)分。CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí)：肉眼觀察結(jié)腸無(wú)損傷，記為0分；輕度充血，水腫，表面光滑，無(wú)糜爛或潰瘍，記為1分；充血水腫，黏膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸粘連，記為2分；高度充血水腫，黏膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑＜1.0 cm，記為3分；在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑＞1.0 cm，或全腸壁壞死，記為4分。

2.3.3 結(jié)腸組織學(xué)觀察及評(píng)分（HS）[13-14]

取大鼠病變最明顯的一段結(jié)腸組織，將其浸入10%中性甲醛緩沖液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)變化并評(píng)分。HS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí)：大鼠結(jié)腸腸黏膜無(wú)水腫、潰瘍，無(wú)組織學(xué)病變，記為0分；腸黏膜輕度水腫、炎癥潰瘍、肉芽腫、上皮細(xì)胞異型增生，病變到達(dá)黏膜層，記為1分；腸黏膜中度水腫、炎癥潰瘍、肉芽腫、上皮細(xì)胞異型增生，病變到達(dá)肌層，記為2分；腸黏膜重度水腫、炎癥潰瘍、肉芽腫、上皮細(xì)胞異型增生，病變到達(dá)漿膜層最后所得的數(shù)值相加評(píng)分，記為3分。

2.3.4 血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的檢測(cè)

打開(kāi)大鼠腹腔，暴露腹主動(dòng)脈。用5 mL的注射器采集全血，保存于血清促凝管。靜置2 h后，4℃低溫離心10 min（2500 r·min-1），吸取上清液，分裝，于-80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法分別對(duì)各組大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平進(jìn)行測(cè)定，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

表1 DAI的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果

3.1 DAI、CMDI及HS評(píng)分結(jié)果

與正常組大鼠比較，模型大鼠DAI、CMDI及結(jié)腸HS評(píng)分均明顯上升，并具有極顯著性差異（P＜0.01）；各給藥組在給藥治療后，DAI、CMDI及結(jié)腸HS評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.01），且由低到高依次為醋乳香2倍劑量組、醋乳香等劑量組、乳香2倍劑量組、乳香等劑量組。其中，醋乳香組DAI與乳香等劑量組之間在給藥1周后的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；醋乳香2倍劑量組CMDI及結(jié)腸HS評(píng)分與其他給藥組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2，表3）。

3.2 結(jié)腸組織病理切片結(jié)果

正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，未見(jiàn)潰瘍、水腫，也無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。模型組可見(jiàn)炎癥累及腸壁全層，部分表面上皮脫落，隱窩破壞，肌層肉芽組織生長(zhǎng)，腺體排列不規(guī)則，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合潰瘍性結(jié)腸炎的組織病理學(xué)改變，病變最為嚴(yán)重（圖1B）。經(jīng)乳香及醋乳香干預(yù)后，各給藥組呈現(xiàn)不同程度的修復(fù)作用，顯微鏡下可見(jiàn)較局部的隱窩破壞伴有上皮再生修復(fù)和腺體增生，增厚的炎癥組織與正常組織交織，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞存在，腺體也有不同程度的改善，而乳香等劑量組（圖1C）及2倍劑量組（圖1D）病理改變遜色于醋乳香等劑量組（圖1E）及2倍劑量組（圖1F）。

表2 DAI評(píng)分的比較（±s,n=10）

表2 DAI評(píng)分的比較（±s,n=10）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較##P＜0.01；與乳香等劑量組比較^^P＜0.01。

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表3 CMDI以及HS評(píng)分的比較（x±s,n=10）

3.3 血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示（圖2），正常組與模型組大鼠血清中細(xì)胞因子的水平分別為T(mén)NF-α：91.93±16.95、232.60±33.201 pg·mL-1，IL-1β：34.00±25.53、249.71±25.527 pg·mL-1，IL-6：336±77.79、587.67±103.62 pg·mL-1，模型組高于正常組，且具有極顯著性差異（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組低于模型組，且具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 各組結(jié)腸組織病理切片結(jié)果

圖2 大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

乳香與醋乳香等劑量組給藥后，結(jié)腸炎大鼠血清中各細(xì)胞因子水平分別為：TNF-α：148.60±45.05、111.933 ±44.78 pg·mL-1，IL-1β：88.29±22.23、66.86±24.31 pg·mL-1，IL-6：436.00±114.20、417.67±103.71 pg·mL-1，與模型組相比，均顯著降低（P＜0.05）。而乳香與醋乳香等劑量組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從數(shù)值趨勢(shì)上看，醋乳香較乳香炎癥因子水平更低。

乳香與醋乳香2倍劑量組血清中各細(xì)胞因子水平分別為：TNF-α：143.27±26.38、101.93±49.10 pg·mL-1，IL-1β：74.00±12.96、39.71±33.38 pg·mL-1，IL-6：434.33±97.87、399.33±128.61 pg·mL-1，與模型組相比，均顯著降低（P＜0.05）。兩個(gè)給藥組之間雖無(wú)顯著性差異，但從數(shù)值趨勢(shì)上看醋乳香2倍劑量組較乳香炎癥因子水平更低。

另外，醋乳香等劑量組與2倍劑量組之間雖無(wú)顯著差異，但從數(shù)值趨勢(shì)上來(lái)看，醋乳香2倍劑量組炎癥因子水平明顯低于等劑量組。

4 討論

UC是一種自身免疫性疾病，與精神、感染、免疫、遺傳等多種因素密切相關(guān)，其病程長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作[15]。TNF-α、IL-1β和IL-6在UC中被公認(rèn)為是促炎細(xì)胞因子，參與UC炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[16]。研究證明細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6水平在UC患者血清中顯著升高，且與病變程度及累及范圍相關(guān)，病情緩解后3種炎癥因子水平顯著降低[17-18]。本研究結(jié)果顯示，TNBS∕乙醇造模后，模型組大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平均顯著高于正常組，結(jié)合DAI、CMDI、HS評(píng)分以及病理學(xué)切片，顯示大鼠UC模型造模成功。三種細(xì)胞因子在陽(yáng)性對(duì)照組中的表達(dá)水平顯著低于模型組，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)具有可靠性。乳香和醋乳香各給藥組大鼠DAI、CMDI以及HS評(píng)分均顯著低于模型組，三種細(xì)胞因子的表達(dá)水平均顯著低于模型組，說(shuō)明乳香、醋乳香可以通過(guò)降低炎癥因子水平對(duì)UC具有明顯的治療作用。綜合各指標(biāo)的數(shù)值趨勢(shì)，提示醋乳香的抗炎作用優(yōu)于乳香，且以2倍劑量組作用最顯著。

乳香中主要含有五環(huán)三萜、四環(huán)三萜、大環(huán)二萜以及揮發(fā)油等成分[19-21]。骨架結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜類化合物的乳香酸組分（Boswellic Acids,BAs），是其最主要的活性組分，具有抗炎作用[22-24]。11-羰基-β-乳香酸（11-keto-β-boswellic acid，KBA）、3-乙酰-11-羰基-β-乳 香 酸（3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA）、α-乳香酸（α-boswellic acid，α-BA）、β-乳香酸（β-boswellic acid，β-BA）、3-乙酰-α-乳香酸（3-acetyl-α-boswellic acid，α-ABA）和3-乙酰-β-乳香酸（3-acetyl-β-boswellic acid，β-ABA）為含量最高的6種乳香酸成分[18]。其中，含有11位羰基結(jié)構(gòu)的11-羰基乳香酸和3-乙酰-11-羰基乳香酸抗炎作用最強(qiáng)[25]。而乳香醋炙后，五環(huán)三萜類成分含量顯著增加，尤以含有11位羰基結(jié)構(gòu)的乳香酸含量增加最多[2]。同時(shí)，醋炙后含量顯著增加的還有9，11-α-去氫-乳香酸、9，11-β-去氫-乳香酸、3-乙酰-9，11-α-去氫乳香酸和3-乙酰-9，11-β-去氫乳香酸，有報(bào)道顯示相較于醋炙前的11-羰基結(jié)構(gòu)成分，具有9，11去氫結(jié)構(gòu)的乳香酸抗炎活性更強(qiáng)[26]。另一方面，乳香酸類成分生物利用度較低，而乳香醋炙后兩個(gè)主要乳香酸成分KBA和AKBA的血藥峰濃度（Cmax）以及藥時(shí)曲線下面積（AUC）均顯著增加[27]。腸外翻實(shí)驗(yàn)也顯示，主要乳香酸成分在乳香醋炙后腸滲透率顯著增加[28]。醋炙后乳香酸成分含量增加，同時(shí)吸收作用增強(qiáng)，這些變化應(yīng)該都與乳香醋炙后抗炎活性的增強(qiáng)有關(guān)。因此導(dǎo)致了與乳香相比，醋乳香可以對(duì)UC發(fā)揮更加顯著的治療作用。本研究在豐富中藥傳統(tǒng)炮制理論同時(shí)，也為UC臨床治療提供了思路。