基于FGF23-Klotho軸探討腎元顆粒對db/db糖尿病腎病小鼠骨骼的保護(hù)作用＊

朱國雙，王 嵐，，鄒新蓉，吳文靜，，孫 龍，鄧丹芳，王小琴＊＊

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院 武漢 430061；3.湖北省中醫(yī)藥研究院 武漢 430061）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的主要微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致骨質(zhì)流失的主要病因之一，也是患者進(jìn)展為終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的首要因素[1]。隨著病情的進(jìn)展，DKD可出現(xiàn)明顯的鈣磷代謝紊亂，并導(dǎo)致破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的活性和相關(guān)破骨蛋白表達(dá)增加，骨細(xì)胞活性降低，新骨形成減少，骨保護(hù)素的表達(dá)減少，骨質(zhì)流失增加等一系列骨質(zhì)代謝紊亂性疾病。因而，預(yù)防和治療DKD患者骨質(zhì)的流失，是目前亟需解決的問題。

Klotho作為抗衰老基因，主要表達(dá)于腎臟中，可與骨分泌的FGF23結(jié)合，參與體內(nèi)的鈣磷代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，腎元顆粒可改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DKD小鼠的腎功能，增加腎臟Klotho蛋白的表達(dá)，減少血FGF23的含量。同時在5∕6腎切除的慢性腎臟?。–KD）大鼠模型中[5]，腎元顆粒具有保護(hù)骨骼，上調(diào)OPG蛋白表達(dá)的作用。為進(jìn)一步探索FGF23-Klotho軸在骨骼中的具體作用機制，本文采用db∕db糖尿病腎病小鼠進(jìn)行研究，通過觀察小鼠骨質(zhì)流失情況，以及FGF23、Klotho蛋白表達(dá)水平，探討其對骨骼的保護(hù)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級7周齡db∕db雄鼠30只（許可證號：SCXK（蘇）-2015-0001；合格證號：32002100006025），同周齡同窩野生型（wild type，WT）小鼠10只（許可證號：SCXK（蘇）-2015-0001；合格證號：32002100006026），購于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院。并飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級屏障環(huán)境動物房。

1.2 材料

腎元顆粒（湖北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑），購于湖北省中醫(yī)院，批號：20190906；厄貝沙坦，購于湖北省中醫(yī)院，賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：8A421。高磷飼料（含磷1.2%、鈣1.6%），購自北京博泰宏達(dá)生物科技有限公司。試劑：FGF23 ELISA試劑購于Bio-Swamp（貨號：MU30742）；ALP試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司（貨號：A059-2）；鈣測試盒購于南京建成生物工程研究所有限公司（貨號：C004-2）；兔抗小鼠一抗Klotho購于美國sigma公司（貨號：SAB3500604）；小鼠抗小鼠一抗FGFR1購于英國abcam公司（貨號：ab824）；兔抗小鼠一抗Osteoprotegerin購于英國abcam公司（貨號：ab9986）；FITC標(biāo)記的驢抗兔二抗、Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購于塞維爾生物技術(shù)有限公司（貨號：GB21301、GB22403）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購于塞維爾生物技術(shù)有限公司（貨號：GB23301）。

1.3 儀器

全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；TGL-16M型高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機設(shè)備有限公司）；SpectraMax?M2型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；DYY-5D型電泳儀，Trans-Blot型SD轉(zhuǎn)膜儀，GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；全自動研磨儀（武漢賽維爾生物）；石蠟切片機（德國Leica公司）；組織包埋機（天津天利航空機電有限公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 db/db小鼠糖尿病腎病模型

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，測量隨機血糖。連續(xù)3次隨機靜脈血糖≥隨機靜脈16.7 mmol·L-1，尿量大于空白組150%，確定糖尿病造模成功。

1.4.2 動物分組及給藥

將30只db∕db小鼠隨機分為3組：模型組、腎元顆粒組、厄貝沙坦組，10只WT小鼠作為正常組；腎元顆粒組按6.0 g·kg-1灌胃腎元顆粒配制的藥液，厄貝沙坦組按30 mg·kg-1沙坦組-1灌胃厄貝沙坦片配制的藥液，3組給藥容積均為20 mL·kg-1，各組連續(xù)給藥12周。

1.4.3 標(biāo)本采集

腹腔麻醉，行摘眼球取血，取血完成后，置于4，低速冷凍離心機中離心，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存。采血完成后，打開小鼠腹腔，摘取小鼠雙側(cè)腎臟，小心剔除包膜，將右側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛中固定，另一側(cè)立即進(jìn)行液氮速凍，隨即轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中待測。取下小鼠雙側(cè)脛骨，將肌肉筋膜剔除干凈，右側(cè)放入4%多聚甲醛中固定；另一側(cè)進(jìn)行液氮速凍，隨即轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中待測。

1.4.4 血清FGF23和骨鈣鹽、ALP活性檢測

將凍存的小鼠血清從-80℃冰箱中取出，冰上解凍分裝凍存的血清，參照小鼠FGF23試劑盒說明，準(zhǔn)備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，進(jìn)行3個復(fù)孔，蓋上封板膜37℃孵化2 h。小心揭開封板膜，棄去孔內(nèi)液體，吸水濾紙上拍干。添加100μL生物標(biāo)記抗體，蓋上新的封板膜，37℃孵化1小時。棄去孔內(nèi)的液體，加入洗滌液200μL，靜置2 min并甩干，重復(fù)3次后棄去液體。每孔加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量每孔的吸光度（OD值）。

將小鼠脛骨從-80℃冰箱中取出，冰上解凍后，進(jìn)行脛骨組織研磨勻漿，離心取上清液。具體操作參照鈣試劑盒。在空白孔中加入10μL去離子水，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入1 mmol·L-1鈣標(biāo)準(zhǔn)液10μL，測定孔中加入10μL樣本液，最后在三者中加入250μL工作液Ⅰ，混勻混勻靜置5 min后，波長610 nm測定每孔的OD值。

小鼠脛骨ALP測定，參照ALP測試盒說明書，在空白孔中加入雙蒸水5μL，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入0.1 mg·mL-1酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液5μL，測定孔中加入待測樣本5μL；同時在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔中依次加入緩沖液50μL和基質(zhì)液50μL，充分混勻37℃水浴15 min后，在各組中加入顯色液150μL，混勻后，波長520 nm，酶標(biāo)儀測定各孔OD值。

1.4.5 Western blot檢測

將小鼠脛骨從-80℃冰箱中取出稱重，稱取的組織放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨勻漿，按1∶5的比例加入蛋白裂解液，搖床4℃裂解過夜，4℃12000 r·min-1低溫離心30 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，每管蛋白50μg，分裝后，-80℃凍存待用。制備分離膠，灌注分離膠，加1 cm的水層，前后震動膠板使膠板水平，室溫靜置60 min，待分離膠凝固后，配置濃縮膠，去掉水層，灌注濃縮膠，插入梳子，室溫靜置60 min。待濃縮膠完全固定后，在電泳槽中加入電泳液，將凝膠放入電泳槽中，拿掉梳子。取出樣本蛋白和Marker水浴煮沸5 min使蛋白發(fā)生變性，樣本蛋白上樣，電泳電壓90 V，待進(jìn)入分離膠后轉(zhuǎn)為110 V。裁剪PCDF膜5.5 cm×5.5 cm，甲醇充分浸透，海綿墊、濾紙Transfer buffer浸透，取出分離膠，按陰極-海綿-濾紙-分離膠-PVDF膜-濾紙-海綿-陽極順序排列，放入電轉(zhuǎn)槽中，50 V轉(zhuǎn)模1.5h。取出PVDF膜，TTBS漂洗，按目的蛋白的大小進(jìn)行裁膜并做好標(biāo)記，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。配置一抗稀釋液，將條帶放入一抗稀釋液中，4℃冰箱搖床過夜，TTBS清洗10 min三次，二抗室溫孵育2 h。TTBS洗膜10 min，滴加A、B發(fā)光液（按1∶1比例混合），BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀曝光、顯影成像，運用Image J進(jìn)行定量分析。

1.4.6 免疫熒光雙標(biāo)檢測

將固定好的腎臟，進(jìn)行石蠟包埋切片，放入2%雙氧水中10 min，室溫漂洗10 min，含0.3%Triton X-100室溫漂洗破膜，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，分別加入一抗，4，過夜后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，用含有DA磷的封片劑封片，激光共聚焦下觀察并拍照。每張切片任選不重復(fù)的3個視野，計數(shù)雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)，取平均值作為測量值。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad prism 6和SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（xˉ±計）表示，采單因素方差分析比較各組之間統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05表示兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠生化指標(biāo)比較

圖1 各組小鼠骨鈣鹽含量

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠生化指標(biāo)結(jié)果

小鼠生化指標(biāo)結(jié)果（表1）：與正常組比，模型組血磷明顯升高，血鈣降低，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明db∕db小鼠伴發(fā)的腎臟損傷可導(dǎo)致體內(nèi)的鈣磷代謝的紊亂。腎元顆粒組血磷降低、血鈣明顯升高，與模型組比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明通過腎元顆粒干預(yù)，小鼠體內(nèi)鈣磷代謝可得到改善。在厄貝沙坦干預(yù)組中，小鼠血磷、血鈣與模型組比，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明厄貝沙坦并不能改善db∕db小鼠鈣磷代謝；且腎元顆粒與厄貝沙坦相比，腎元顆粒具有優(yōu)化鈣磷代謝的作用。

2.2 小鼠骨鈣鹽檢測結(jié)果

骨鈣鹽結(jié)果提示（圖1），模型組骨鈣含量低于WT組，與WT組比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明db∕db糖尿病腎病小鼠存在骨鈣的流失。腎元顆粒組小鼠骨鈣流失減少，與模型組比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明腎元顆粒具有保護(hù)骨鈣流失的作用；厄貝沙坦組小鼠骨鈣鹽流失與模型組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明厄貝沙坦對小鼠骨骼鈣鹽代謝無調(diào)節(jié)作用；腎元顆粒組與厄貝沙坦組比，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.014＜0.05），表明腎元顆粒對骨鈣鹽代謝調(diào)節(jié)作用，優(yōu)于厄貝沙坦組。

圖2 各組小鼠ALP活性檢測結(jié)果

圖3 各組小鼠血清FGF23含量結(jié)果

2.3 各組小鼠骨骼ALP活性檢測

ALP活性結(jié)果提示（圖2），與WT組比，模型組骨骼ALP活性明顯降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明db∕db糖尿病腎病小鼠存在骨骼ALP的活性降低。與模型組比，腎元顆粒可增加骨骼中ALP的活性，兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而厄貝沙坦組用藥后與模型組比，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這表明厄貝沙坦對于小鼠的ALP活性沒有明顯的影響；腎元顆粒組與厄貝沙坦組比，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這表明腎元顆粒增加ALP活性要優(yōu)于厄貝沙坦。

2.4 各組小鼠血FGF23含量

FGF23含量結(jié)果提示（圖3），模型組小鼠血FGF23含量明顯升高，與WT組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明db∕db小鼠伴發(fā)的腎臟損傷，可導(dǎo)致體內(nèi)FGF23的急劇升高；給予腎元顆粒和厄貝沙坦后，兩組小鼠血FGF23含量明顯減少，與模型組比，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明腎元顆粒和厄貝沙坦均能有效的降低血FGF23含量；而與厄貝沙坦組比，腎元顆粒組小鼠血FGF23降低程度優(yōu)于厄貝沙坦組，且兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明腎元顆粒在改善db∕db糖尿病腎病小鼠血FGF23含量水平上優(yōu)于厄貝沙坦。

2.5 各組小鼠骨骼OPG含量結(jié)果

各組小鼠OPG結(jié)果提示（圖4），模型組小鼠骨骼OPG蛋白表達(dá)明顯降低，與WT組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這表明db∕db糖尿病腎病小鼠存在OPG表達(dá)的丟失；與模型組比，腎元顆粒組小鼠OPG蛋白表達(dá)升高，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這表明腎元顆?？稍黾觗b∕db小鼠骨骼中骨保護(hù)素的表達(dá)；模型組與厄貝沙坦組比，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明厄貝沙坦能上調(diào)OPG蛋白的含量；而腎元顆粒組與厄貝沙坦組比，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明腎元顆粒上調(diào)OPG蛋白表達(dá)優(yōu)于厄貝沙坦。

圖4 各組小鼠骨骼OPG蛋白含量結(jié)果

圖5 Klotho和FGFR1免疫熒光激光共聚焦掃描結(jié)果

2.6 各組小鼠免疫熒光激光共聚焦掃描結(jié)果

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，WT組小鼠可觀察到完整的腎單位，Klotho集中表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞中，且分布均勻；模型組腎單位破損最為嚴(yán)重，Klotho表達(dá)較少；腎元顆粒組腎單位破損最輕，Klotho表達(dá)較多；厄貝沙坦組次之（圖5）。

在對陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，WT組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)最多，其與模型組比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，腎元顆粒組和厄貝沙坦組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均有顯著的增加，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與厄貝沙坦組比，腎元顆粒組小鼠腎臟陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)優(yōu)于厄貝沙坦組，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

db∕db小鼠屬于自發(fā)性2型糖尿病模型，該小鼠模型屬于4號染色體的瘦素受體（Leptin receptor）基因發(fā)生突變所致，下丘腦對飽感物質(zhì)（瘦素）缺乏反應(yīng)，不能產(chǎn)生飽感，進(jìn)食增多，體內(nèi)合成代謝明顯大于分解代謝，引起脂肪的堆積而肥胖，而隨著病情的進(jìn)展，出現(xiàn)不同程度的腎臟損傷，誘發(fā)DKD[6]。

DKD屬于中醫(yī)“消渴病”范疇；消渴日久，腎體受損，傷陰耗氣，氣陰兩虛，氣虛血運無力，出現(xiàn)瘀血、痰濁、熱毒等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生。腎體受損，腎精不足，骨髓生化乏源，骨骼失去充養(yǎng)，導(dǎo)致骨質(zhì)的流失。腎元顆粒（原名：腎安顆粒）是根據(jù)邵招娣教授多年致力于DKD治療和研究的新藥[7]。以補腎健脾，通腑泄?jié)釣橹委熢瓌t，配伍黃芪、淫羊藿和大黃組成腎元顆粒。腎元顆粒方中以黃芪為君，取其補氣升陽、托毒生肌、利水除濕之功；淫羊藿為臣，取其溫腎健脾、強筋壯骨之效；加之酒制大黃為佐使，化瘀解毒、通腑泄?jié)?。三藥合用，可達(dá)標(biāo)本兼治之功。

FGF23-Klotho軸是調(diào)控鈣磷代謝的主要激素，協(xié)同調(diào)控血鈣磷吸收、尿鈣磷重吸收與排泄、骨鈣磷沉積與釋放，共同維持機體內(nèi)的鈣磷代謝平衡。Klotho主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞中，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)[8-9]。在腎遠(yuǎn)端小管，Klotho蛋白可與FGFR1相結(jié)合，形成Klotho∕FGFR1復(fù)合受體[10-11]，并特異性的與FGF23結(jié)合，增加FGF23與FGFR1之間的親和力，形成FGF23∕FGFR1∕Klotho三元復(fù)合物，激活早期生長反應(yīng)因子1（Egr1），抑制1，羥化酶活性表達(dá)，增加24-羥化酶活性的表達(dá)，減少活性維生素D的合成，使其降解增加，減少磷在小腸中的重吸收[12-13]。在近端小管，F(xiàn)GF23-Klotho軸的激活可抑制腎小管上皮細(xì)胞中鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運子2a（NaPi2a）和鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運自2c（NaPi2c）表達(dá)的，減少腎小管對磷的重吸收，增加尿磷的排泄[14-17]，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝的平衡。

鈣、磷為骨礦物質(zhì)鹽的主要成分，參與和調(diào)節(jié)骨硬度的構(gòu)成。體內(nèi)99%的鈣以羥磷灰石結(jié)晶的方式儲存于骨組織中，剩余1%鈣存儲于體液和軟組織中。而體內(nèi)的磷，86%以磷酸鈣形式存儲于骨組織中，剩余14%磷則存儲于細(xì)胞中?？梢?，骨組織是鈣磷儲存的重要場所，是維持體內(nèi)鈣磷平衡的重要器官[18]。通過檢測骨骼和血清中鈣磷的含量，可從直接的角度和間接的角度反應(yīng)骨質(zhì)流失的情況。

骨組織骨量及內(nèi)在的生物力學(xué)性能等指標(biāo)是骨性能判定的重要指標(biāo)[19]。骨量的減少以及骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨生物力學(xué)，可降低生物力學(xué)強度?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，OPG作為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，其在骨質(zhì)流失過程發(fā)生中有重要意義[20]。OPG與其配體OPGL結(jié)合后，可抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子表達(dá)，抑制成熟破骨細(xì)胞的活性。

此次實驗發(fā)現(xiàn)，腎元顆?？擅黠@降低血清中異常升高的FGF23含量，并能明顯增加腎臟中Klotho和FGFR1陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，使得體內(nèi)FGF23-Klotho軸得到恢復(fù)。隨著該軸功能得到恢復(fù)，db∕db小鼠體內(nèi)的鈣磷代謝也得到明顯改善。通過血磷和血鈣水平的觀察發(fā)現(xiàn)，腎元顆粒能明顯降低血磷，增加血鈣含量，改善體內(nèi)鈣磷代謝。而這一作用也間接反應(yīng)腎元顆粒對骨骼的保護(hù)作用。為進(jìn)一步觀察腎元顆粒對骨骼的保護(hù)作用，此次實驗通過檢測骨組織中ALP活性、骨鈣鹽含量以及OPG蛋白的表達(dá)情況，直接觀察骨組織中成骨細(xì)胞的活動和骨骼骨量、骨質(zhì)流失的情況[21-22]。此次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎元顆?？稍黾庸墙M織中骨鈣鹽的含量，上調(diào)骨組織中ALP的活性，增加骨骼中OPG蛋白的表達(dá)，這表明腎元顆粒具有抑制骨質(zhì)流失，增加成骨細(xì)胞活動，最終達(dá)到骨骼保護(hù)作用。

綜上所述，F(xiàn)GF23-Klotho軸交通著腎臟與骨骼，并將兩者聯(lián)系在一起，這與中醫(yī)“骨腎同源”理論相合。腎藏精為腎臟的基本生理功能，其所藏之精可充養(yǎng)骨髓，與骨同出一源。通過對FGF23-Klotho軸的研究，有助于從分子生物學(xué)角度理解“骨腎同源”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，同時也為揭示中醫(yī)“腎-精-髓-骨”關(guān)聯(lián)理論的科學(xué)內(nèi)涵和價值提供了有力的證據(jù)支持，為DKD的治療提供新的思路。