無患子總皂苷提取工藝優(yōu)化及其對酪氨酸酶的抑制活性

劉俊宏 邱智東

關(guān)鍵詞：無患子;總皂苷;提取工藝;富集工藝;正交試驗(yàn);酪氨酸酶;黑色素

無患子產(chǎn)于長江流域以南[1]，《本草綱目》《雞肋篇》均有記載，稱為肥珠子、油珠子[2]。無患子果皮皂苷成分主要為三萜及倍半萜類，具有較強(qiáng)的表面活性作用[3-4]，含量達(dá)5.33%[5]?！侗静菥V目》中載：洗頭去風(fēng)明目，洗面增白祛斑。在現(xiàn)代中藥及天然藥物化學(xué)研究中認(rèn)為，無患子中活性物質(zhì)可以通過對酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互變酶的作用，抑制黑色素的產(chǎn)生，從而達(dá)到美白效果。在這其中，酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶，對酪氨酸酶活性的控制，是美白護(hù)理的關(guān)鍵。近年來雖有報道無患子提取物對酪氨酸酶有抑制作用[6-7]，但對無患子總皂苷提取工藝優(yōu)化及對酪氨酸酶活性抑制作用鮮有新的報道，本研究擬通過優(yōu)化無患子總皂苷提取工藝、考察無患子皂苷對酪氨酸酶活性的抑制作用，來評價無患子總皂苷美白護(hù)膚的作用效果，為無患子在美白護(hù)膚化妝品的工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與材料

試驗(yàn)儀器：藥物天平（JYT-2，上海醫(yī)用激光儀器廠）;電子天平[AL-204，梅特勒-托利多（上海）有限公司];超聲提取器（SY-360，上海寧商超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（WMZK-72，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9035A，上海源長實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠）;恒溫水浴鍋（HH-S6，天津先權(quán)有限公司）;酶標(biāo)儀（SpectraMax PLus-384，美谷分子儀（上海）有限公司）旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（R-3001，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

試驗(yàn)材料：無患子（2018年12月購于海寧市鹽官苗木合作社，產(chǎn)于浙江）由長春中醫(yī)藥大學(xué)董金香教授鑒定;酪氨酸酶（25 000 mg，Sigma公司）;DOPA（Sigma公司）;磷酸緩沖鹽（北京化工有限公司）;熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110742-201620，中國藥品生物制品檢定所）。大孔吸附樹脂D101（上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無患子總皂苷提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，甲醇定容至50 mL，配制成為 0.25 mg/mL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。分別精確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL配制好的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于比色皿中，70 ℃下水浴蒸干溶液，將蒸干后各比色皿中分別加入3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 mL 60% H2SO4溶液，充分振蕩，搖勻。將得到溶液于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min，冷卻后靜置15 min，待測。以空白溶液為參比，于520 nm波長處測定各組樣品的吸光度[8-9]。以測得結(jié)果的吸光度為縱坐標(biāo)和對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 單因素考察

1.2.1.2.1 乙醇濃度考察 稱取無患子果皮30 g，料液比為1 g ∶ 10 mL提取時間，為30 min條件下，將乙醇濃度設(shè)定為10%、30%、50%、70%、90%，分別進(jìn)行提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較。

1.2.1.2.2 提取時間考察 稱取無患子果皮30 g，以10%乙醇為提取溶劑，在35 ℃料液比為 1 g ∶ 10 mL 條件下，將提取時間設(shè)定為30、60、90、120、150 min，分別提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較。

1.2.1.2.3 料液比考察 稱取無患子果皮30 g，以10%乙醇為提取溶劑，在35 ℃提取30 min條件下，將料液比（g ∶ mL）設(shè)定為1 ∶ 10、1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 90，分別提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較[10-12]。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)選擇超聲提取法進(jìn)行無患子總皂苷的提取。按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，選擇提取溶劑濃度、提取時間、料液比為考察因素（表1），選擇無患子總皂苷含量為考察指標(biāo)設(shè)計試驗(yàn)。

1.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按照“1.2.2”節(jié)下所得最優(yōu)提取方案連續(xù)提取3次，通過3次總皂苷得率結(jié)果，考察最優(yōu)方案的穩(wěn)定性。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率測定方法

1.2.4.1 樣品制備 稱量1 000 g無患子果皮粉末，使用所得的最佳工藝提取無患子總皂苷，濃縮提取液，蒸干提取液成干膏，備用。

1.2.4.2 大孔樹脂吸附富集 取3份最優(yōu)方案提取總提取物，每份取10 g，分別定容至50 mL容量瓶中。準(zhǔn)確量取已經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂200 mL 3份，濕法裝柱分別標(biāo)號：Y-1（水-D101）、Y-2、Y-3，分別上樣10 g提取物，依次以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3倍體積量依次洗脫。收集洗脫液，揮干溶劑，制成干膏，分別稱質(zhì)量，待用[13]。

1.2.4.3 有機(jī)試劑萃取 取“1.2.4.1”節(jié)下制得總提取物10 g，溶于100 mL蒸餾水中，轉(zhuǎn)入分液漏斗，依次分別加入100 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（水飽和）萃取，分別收取萃取液及萃取后所得水層，于50 ℃下分別減壓濃縮干燥，制成干膏，稱質(zhì)量后待用。

1.2.4.4 試驗(yàn)溶液配制

1.2.4.4.1 供試品溶液配制 取“1.2.4.2”“1.2.4.3”節(jié)下制得的干膏各5 mg，用磷酸緩沖液分別定容至5、10、25 mL容量瓶中配成1、0.5、0.25 mg/mL 質(zhì)量濃度的溶液待用作為供試品溶液。

1.2.4.4.2 陽性對照溶液配制 取熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，依照“1.2.4.4.1”節(jié)方法配制成為1、0.5、025 mg/mL的溶液作為陽性對照待用。

1.2.4.5 檢測方法 精確吸取不同質(zhì)量濃度試驗(yàn)溶液、分別依次按照表2將試驗(yàn)溶液加入于96孔板中A、B、C、D中，置于酶標(biāo)儀中，并于450 nm處測吸光度，得出不同樣品溶液的抑制率作比較。依據(jù)公式計算酪氨酸酶的抑制百分率[14]：抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見圖1，按“1.2.1.1”節(jié)下方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示：y=0.613x-0.059 5，r2=0.999 1，齊墩果酸在0.125～0.875 mg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 提取工藝條件考察

2.2.1 單因素考察試驗(yàn)結(jié)果 以無患子總皂苷含量為參考指標(biāo)，分別對影響總皂苷提取率的乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)等試驗(yàn)因素作為研究對象，按照“1.2.1.2”節(jié)下試驗(yàn)考察上述因素。

2.2.1.1 乙醇濃度對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時提取溶液乙醇濃度對總皂苷得率影響，結(jié)果如圖2所示。隨著提取溶劑中乙醇濃度不斷增加，總皂苷得率與乙醇濃度呈正相關(guān)，當(dāng)提取液乙醇濃度高于50%時，總皂苷得率呈下降趨勢，而當(dāng)乙醇濃度在40%～60%時，總皂苷得率較高且得率較接近，因此，綜合考慮試驗(yàn)成本，應(yīng)當(dāng)考察乙醇濃度為40%、50%、60%時乙醇濃度對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.2.1.2 提取時間對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時提取時間對總皂苷得率影響，結(jié)果如圖3所示。隨著提取時間的不斷增加，在0～1.5 h時間范圍內(nèi)總皂苷提取率與提取時間呈正相關(guān)，當(dāng)提取時間超過15 h時，總皂苷提取率沒有明顯降低，因此，綜合考慮試驗(yàn)成本，應(yīng)當(dāng)考察提取時間為0.5、1.0、1.5 h時，提取時間對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.2.1.3 料液比對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時料液比對總皂苷得率影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)料液比為 1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL時總皂苷得率隨提取液增加而提高，呈現(xiàn)這種規(guī)律的原因是隨著提取溶劑比例增加，無患子果皮中活性物質(zhì)逐漸從細(xì)胞內(nèi)部溶出并擴(kuò)散到溶液中。當(dāng)料液比為 1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 90 mL時總皂苷得率呈下降趨勢。綜上，考慮到試驗(yàn)成本及總皂苷提取效果，選擇料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL 時，提取料液比對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果（表3、表4）表明，在正交試驗(yàn)結(jié)果表（表3）中 RA>RC>RB，因此，無患子總皂苷提取率影響因素從大到小依次為：溶劑濃度>料液比>提取時間，根據(jù)直觀分析對于A因素提取溶劑濃度 k3>k2>k1;對于B因素提取時間k3>k1>k2;對于C因素料液比k3>k2>k1;可得出最佳提取工藝為A3B3C1，即：以60%乙醇為提取溶劑，提取時間 1.5 h，料液比1 g ∶ 30 mL進(jìn)行提取。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對篩選后的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)， 提取率分別為8.76%、8.71%、8.89%，RSD值為106%，表明本試驗(yàn)確定的提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.5 對酪氨酸酶的抑制活性

由表5可以看出，2種不同富集方式總皂苷得率不同，各組分得膏率順序如下：水飽和正丁醇得膏率>Y-3（70%乙醇）>H2O>Y-1（水-D101）>Y-2（30%乙醇）>乙酸乙酯>石油醚，在考察各個樣品體外對酪氨酸酶抑制活性時，不同富集方式得到的樣品抑制率有顯著不同，如表6所示，在初始質(zhì)量濃度（0.25 mg/mL）下，各樣品抑制率較接近，無明顯區(qū)別，在中間質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL）下，較其他樣品，熊果苷對酪氨酸酶抑制作用最強(qiáng)，其抑制率為46.77%，石油醚次之，其抑制率為4482%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率為4462%，在高質(zhì)量濃度（1 mg/mL） 時，各樣品對酪氨酸酶抑制活性基本與中間濃度時表現(xiàn)一致，其中熊果苷對酪氨酸酶抑制作用最強(qiáng)，其抑制率為84.69%，石油醚次之，其抑制率為81.25%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率為8022%。但石油醚得率較低，考慮成本問題，D101大孔樹脂富集法70%乙醇洗脫更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，綜上，無患子果皮提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，因此，可作為美白產(chǎn)品添加劑，綜合考察得膏率及抑制率，通過大孔樹脂D101，70%乙醇洗脫后得到總皂苷對酪氨酸酶活性抑制效果最好，因此，可選此工藝為無患子總皂苷富集工藝。

3 討論與結(jié)論

酪氨酸酶在人體皮膚黑色素生成系列反應(yīng)中具有重要的生理功能，抑制酪氨酸酶活性可以阻斷人體皮膚黑色素形成，從而起到美白皮膚的效果，本試驗(yàn)以天然藥物無患子為研究對象，優(yōu)化無患子總皂苷提取、富集工藝并合理評價無患子總皂苷的體外酪氨酸酶抑制效果。

在無患子提取工藝研究中，分別對影響無患子總皂苷提取得率的因素：乙醇濃度、提取時間、料液比進(jìn)行單因素考察試驗(yàn)，并以無患子總皂苷得率為參考指標(biāo)，通過正交設(shè)計優(yōu)化得到無患子總皂苷提取工藝為：提取溶劑為60%乙醇，提取時間為 1.5 h，料液比為1 g ∶ 30 mL，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證此方法穩(wěn)定可靠。

本試驗(yàn)不僅對無患子總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，還進(jìn)一步考察了無患子提取物體外酪氨酸酶抑制活性。為提高無患子提取物的應(yīng)用效率，又分別對無患子提取物進(jìn)行2種純化方式下的得膏率和酪氨酸酶活性抑制作用的考察。水飽和正丁醇組得膏率相對較高，為43.12%，但其對酪氨酸酶抑制活性相對較差，因此不選作較優(yōu)的富集方案;石油醚層組分雖相同質(zhì)量濃度下對酪氨酸酶抑制活性與熊果苷接近，但由于其得膏率較低，不作選擇，考慮到成本問題遂選擇無患子提取物通過大孔樹脂D101、70%乙醇洗脫方法對無患子提取物進(jìn)行富集純化。純化后無患子總皂苷提取物利用效率更高，對酪氨酸酶抑制活性更強(qiáng)，能更好地發(fā)揮無患子的美白功效。

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