膠質(zhì)瘤中BRAF基因異常的研究進(jìn)展

孫夢(mèng)雪 王雷明 滕梁紅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院病理科,北京 100053)

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤類型，占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的50%～60%，近年來發(fā)病率正在呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)[1]。由于顱內(nèi)腫瘤部位的特殊性，在膠質(zhì)瘤治療手段的選擇上受到很大限制，治療效果也差強(qiáng)人意。目前，隨著對(duì)腫瘤分子水平研究的不斷深入，越來越多的分子遺傳學(xué)特征在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面發(fā)揮重要的指導(dǎo)作用[2]。絲氨酸/蘇氨酸激酶v-RAF鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1(the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1，BRAF)基因異常是較為常見的腫瘤相關(guān)性分子改變，其中BRAFV600E點(diǎn)突變?cè)诎谞钕偃轭^狀癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、毛細(xì)胞白血病等多種腫瘤中均被檢測(cè)到，并且已經(jīng)成為重要的治療靶點(diǎn)[3]。而近些年來，在一些特殊的膠質(zhì)瘤類型中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了BRAF基因的異常，這其中除了常見的BRAFV600E點(diǎn)突變，還包括BRAF基因融合[4]。這些發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的診斷及綜合治療提供了新的手段和方向。本文將目前BRAF基因異常在膠質(zhì)瘤診斷和治療中的應(yīng)用進(jìn)展做一綜述。

1 膠質(zhì)瘤中BRAF基因的異常

BRAF基因位于染色體7q34，與ARAF基因及CRAF基因共同構(gòu)成了RAF基因家族。其編碼的BRAF蛋白參與肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)-RAF-絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase，MEK)-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)-有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK),即RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路的調(diào)節(jié)。MAPK通路開始于跨膜受體酪氨酸激酶的活化，并通過與酪氨酸激酶受體結(jié)合以及自磷酸化激活RAS，進(jìn)而激活RAF及下游的MEK1/2,最終導(dǎo)致ERK1/2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活，引起細(xì)胞的增生及腫瘤的發(fā)生。但另一方面，當(dāng)該通路下游的抑癌基因p16INK4a、p19ARF、p53 和PTEN等發(fā)揮作用時(shí)，又可以引起細(xì)胞的分化及衰老。當(dāng)BRAF基因出現(xiàn)異常時(shí)，不需要RAS的活化就可以激活下游的信號(hào)分子，MAPK通路持續(xù)活化，該機(jī)制被認(rèn)為與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生均有關(guān)[5]。目前已知的與膠質(zhì)瘤相關(guān)的BRAF基因異常主要包括BRAF突變和BRAF融合。

BRAFV600E突變是一種錯(cuò)義突變，是第600位的谷氨酸替代了纈氨酸，這也是BRAF突變最常見的(約占90%)一種突變形式。BRAFV600E突變導(dǎo)致高水平的BRAF激酶活性和高水平的磷酸化和活化ERK，使MAPK通路持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。BRAFV600E突變激活MAPK 信號(hào)的能力與RAS活性無關(guān)。事實(shí)上，在BRAFV600E突變的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)RAS活性水平被抑制，這是由于下游的ERK被激活，產(chǎn)生強(qiáng)烈的負(fù)反饋所致[5]。

BRAF的融合在2008年才被首次報(bào)道[4]。Jones等[4]描述了1例毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤中位于7q34上2Mb的串聯(lián)重復(fù)序列，并證實(shí)是BRAF與同在一條染色體上的基因KIAA1549之間出現(xiàn)了融合。BARF與KIAA1549最常見的融合位點(diǎn)是KIAA1549的16號(hào)外顯子和BRAF的9號(hào)外顯子融合，其次還有15-9和16-11等方式。隨后研究者[4，6-7]發(fā)現(xiàn)BRAF基因融合時(shí)，RAF的N端可以被KIAA1549、FAM131B、SRGAP3或GTF2I等替代，RAF的N端自抑制域丟失，解除了對(duì)C末端結(jié)構(gòu)域的抑制，使MAPK通路異常激活，隨后，Shin 等[8]在小鼠模型上又發(fā)現(xiàn)，C末端激酶結(jié)構(gòu)域本身的激活可能還不足以具有致瘤性，但協(xié)同 Ink4a(p16)/Arf(p14)的丟失卻可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生。

2 BRAF V600E基因突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的意義

BRAFV600E基因突變是腫瘤中比較常見的分子改變，發(fā)生于人類約7%的惡性腫瘤，包括毛細(xì)胞白血病(幾乎100%)、黑色素瘤(約45%)、甲狀腺乳頭狀癌(約45%～70%)、結(jié)直腸癌(8%～15%)及非小細(xì)胞肺癌(2%～5%)等[3]。在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，如膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、乳頭型顱咽管瘤中也較為常見。在膠質(zhì)瘤中,BRAFV600E突變主要發(fā)生在一組異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)野生型的膠質(zhì)瘤，包括毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤(pilocytic astrocytomas,PA)(12.5%)、節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤和間變型節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤(ganglioglioma，GG)(50%)、多形性黃色星形細(xì)胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma，PXA)(約55%)、上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(epithelioid glioblastoma,eGBM)(58%)等[9-10]。詳見表1。值得注意的是，在這組腫瘤中，除了毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤以外，BRAFV600E突變主要見于一組形態(tài)上以上皮樣細(xì)胞為特征的膠質(zhì)瘤(間變性GG、PXA、間變型PXA和上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。這幾種腫瘤的組織學(xué)級(jí)別及預(yù)后不一，但在形態(tài)及分子特征上卻存在一定的相似性，而且陸續(xù)出現(xiàn)了一些它們之間存在相關(guān)性的報(bào)道。Tanaka等[11]曾報(bào)道了1例具有BRAFV600E突變的PXA患者手術(shù)后13年發(fā)展成eGBM，另一項(xiàng)研究[12]中也報(bào)道了1例由間變型PXA發(fā)展成eGBM的病例。關(guān)于PXA和GG的相關(guān)性也有報(bào)道，如Cicuendez等[13]及王雷明等[14]均報(bào)道過混合性PXA-GG的病例，也提示兩種腫瘤可能存在一定的同源性。2018年Murakami等[15]首次報(bào)道1例具有上皮樣細(xì)胞的間變型節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤，上皮樣細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞均檢測(cè)到BRAFV600E突變，因此認(rèn)為節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤可能是上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的前驅(qū)病變，這些形態(tài)學(xué)和分子層面證據(jù)的出現(xiàn)也提示這幾種腫瘤可能屬于同一疾病譜系。由于BRAFV600E突變?cè)谑澜缧l(wèi)生組組(World Health Organization， WHO)I～I(xiàn)V級(jí)的多種膠質(zhì)瘤中均可出現(xiàn)，因此在鑒別診斷中的意義有限，但在一些特定情況下卻對(duì)病理診斷很有幫助。例如：在低級(jí)別的彌漫性膠質(zhì)瘤(WHOⅡ級(jí) )累及大腦皮質(zhì)時(shí)，需要和節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤(WHOⅠ級(jí))進(jìn)行鑒別，如果存在BRAF的突變，則支持后者；PXA(WHOⅡ～Ⅲ)或上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和巨細(xì)胞膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO Ⅳ級(jí))都可以出現(xiàn)胞質(zhì)豐富的上皮樣細(xì)胞，但巨細(xì)胞膠質(zhì)母細(xì)胞瘤通常不具有BRAF的突變[16]。

檢測(cè)BRAFV600E突變?cè)陬A(yù)后方面的價(jià)值主要體現(xiàn)在兒童膠質(zhì)瘤中，目前研究者[17]認(rèn)為BRAFV600E突變是一種預(yù)后相對(duì)較差的標(biāo)志物，比如發(fā)生于腦干BRAFV600E突變的GG(WHOⅠ級(jí))復(fù)發(fā)率要高于野生型；兒童間腦BRAFV600E突變的低級(jí)別膠質(zhì)瘤更具侵襲性，尤其是13歲以下的兒童[18]。但是也有研究者發(fā)現(xiàn)在兒童中線的膠質(zhì)瘤中,當(dāng)存在H3K27M和BRAFV600E雙重突變時(shí)，相對(duì)于H3K27M單一突變的彌漫中線膠質(zhì)瘤，患者具有更長的生存期[19]。因此對(duì)于同一病例中同時(shí)出現(xiàn)多個(gè)基因改變的臨床意義尚需更多的研究和數(shù)據(jù)。

表1 膠質(zhì)瘤中BRAF基因的異常改變[9-10]

BRAF： the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1；WHO： World Health Organization；PA: pilocytic astrocytoma；GG:ganglioglioma；PXA: pleomorphic xanthoastrocytoma；eGBM: epithelioid glioblastoma；PMA: pilomyxoid astrocytoma；DLGNT: diffuse leptomeningeal glioneuronal tumor.

對(duì)于存在BRAFV600E突變的膠質(zhì)瘤，已經(jīng)有研究者[20-21]嘗試將其作為治療靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療。如BRAF抑制劑維羅非尼(Vemurafenib)和達(dá)帕菲尼(Dabrafenib)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration， FDA)批準(zhǔn)用于BRAFV600E突變的晚期惡性黑色素瘤患者[20]。Kaley等[21]的研究表明Vemurafenib對(duì)BRAFV600E突變的膠質(zhì)瘤患者具有較持久的抗腫瘤活性，但在不同的組織學(xué)類型中治療效果不同，其中以PXA患者治療效果最好。此外，也有單獨(dú)應(yīng)用Dabrafenib成功治療BRAFV600E突變膠質(zhì)瘤以及復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的個(gè)案報(bào)道[22]。同時(shí)有研究[23]結(jié)果顯示對(duì)于BRAF抑制劑耐藥的患者，MEK抑制劑曲美替尼(Trametinib)聯(lián)合BRAF抑制劑Dabrafenib可以克服單藥治療的耐藥性。

3 BRAF基因融合在膠質(zhì)瘤中的意義

BRAF基因融合最常見的配體是KIAA1549基因，該基因目前的功能尚不明確，但兩者可以通過串聯(lián)重復(fù)導(dǎo)致KIAA1549-BRAF融合。膠質(zhì)瘤中，KIAA1549-BRAF融合主要發(fā)生在毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤(>70%)及彌漫性軟腦膜膠質(zhì)神經(jīng)元腫瘤(75%)，其他常見的還包括毛黏液樣型星形細(xì)胞瘤(40%～50%)和節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤(18%)。詳見表1。PA中最常見的KIAA1549-BRAF融合形式是 16-9外顯子融合，且多發(fā)生于小腦，而外顯子15-9融合常出現(xiàn)在中線部位[24-25]。有研究者[26]認(rèn)為BRAF基因融合形式與組織病理學(xué)形態(tài)存在相關(guān)性，KIAA1549-BRAF融合與PA中毛細(xì)胞形態(tài)有一定的聯(lián)系， 外顯子16-9融合更容易形成雙相模式，而外顯子15-9融合更多見于富于黏液的腫瘤。KIAA1549-BRAF融合在PA中的高檢出率，在PA與兒童低級(jí)別彌漫性膠質(zhì)瘤的鑒別診斷中發(fā)揮了重要作用[27]。此外，目前的研究[25]也顯示，KIAA1549-BRAF融合的膠質(zhì)瘤傾向于更長的無進(jìn)展生存期。另有研究[28]表明應(yīng)用KIAA1549-BRAF融合的高檢出率有助于PA的進(jìn)一步研究，比如有研究通過激光顯微切割，獲得PA患者手術(shù)切除標(biāo)本中增生的微血管成分和腫瘤細(xì)胞成分，分別檢測(cè)KIAA1549-BRAF融合，結(jié)果提示增生的微血管的某些細(xì)胞成分可能與腫瘤細(xì)胞具有同一起源。BRAF基因融合的配體除KIAA1549外，近幾年還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些其他的配體基因，如eFAM131、SRGAP3、RNF130、CLCN6、MKRN1、GNAI1、GTF2I等，不同的配體在腫瘤發(fā)生過程中的作用可能有所差別，但目前由于發(fā)現(xiàn)其他配體的多是個(gè)案報(bào)道，尚無法判斷其對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的影響差異[7]。

目前，BRAF抑制劑對(duì)KIAA1549-BRAF基因融合相關(guān)的膠質(zhì)瘤治療效果欠佳。具有KIAA1549-BRAF基因融合的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系對(duì)BRAF抑制劑Vemurafenib(研究類似物PLX4720)具有天生的耐藥性，在PLX4720治療后反而被矛盾地激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞加速生長[29]。Jain等[30]研究結(jié)果顯示PI3K-AKT-mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)是BRAF融合的主要逃避機(jī)制，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用Trametinib和依維莫司(Everolimus,mTOR抑制劑)可延緩腫瘤生長速度，抑制、延緩腫瘤獲得性耐藥的產(chǎn)生。

4 BRAF基因異常的檢測(cè)

BRAFV600E突變的檢測(cè)方法包括多種[31-33]。在臨床上應(yīng)用最廣泛的是免疫組織化學(xué)染色法，通過檢測(cè)BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)來間接反映BRAFV600E基因突變情況。檢測(cè)成本相對(duì)低廉，檢測(cè)快速，操作簡便，靈敏度和特異度均較高[31]，但結(jié)果的判讀有時(shí)依賴于染色的質(zhì)量，主觀性較強(qiáng)。直接測(cè)序法特異度較高，但操作較復(fù)雜，耗時(shí)長，靈敏度稍差，目前在臨床工作中應(yīng)用的并不廣泛。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)雖然靈敏度較高，但具有較差的特異度，因?yàn)樗峭ㄟ^擴(kuò)增的突變基因序列來間接識(shí)別的[32]。Bisschop等[33]的研究表明Idylla檢測(cè)法不僅可以識(shí)別BRAFV600E突變，還可以檢測(cè)到BRAF其他位點(diǎn)的突變，其檢測(cè)過程無須進(jìn)行DNA分離，適合BRAF基因突變的快速檢測(cè)，但其價(jià)格昂貴，臨床推廣較為困難。

目前對(duì)于KIAA1549-BRAF基因融合的檢測(cè)臨床上應(yīng)用最多的仍然是熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization， FISH)檢測(cè)法，檢測(cè)與融合伙伴、融合連接、重排片段大小以及融合基因表達(dá)均無關(guān)，操作方便、可以直觀觀察，但缺點(diǎn)在于不能判斷融合伙伴。檢測(cè)BRAF基因融合的FISH探針包括分離探針和融合探針兩種類型，分離探針可以檢測(cè)出未知片段融合，略優(yōu)于融合探針，但仍無法判斷具體的配體基因。RNA測(cè)序法是檢測(cè)重排最基礎(chǔ)、最直接及最準(zhǔn)確的方法，但其主要限制是需要新鮮標(biāo)本，以及不能檢測(cè)到涉及非轉(zhuǎn)錄區(qū)域的重排事件。此外，由于表達(dá)的動(dòng)態(tài)范圍廣，組織特異性強(qiáng)，低水平表達(dá)的融合基因也難以檢測(cè)到。Nano String技術(shù)是多重基因定量檢測(cè)技術(shù)，此技術(shù)可直接檢測(cè)條形碼探針標(biāo)記的單個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄子，不需要擴(kuò)增就可以單獨(dú)計(jì)數(shù)，其特異度及靈敏度較高，而且對(duì)于冰凍切片及石蠟切片都有功能，因此，也是BRAF融合檢測(cè)的方法選擇之一，但其缺點(diǎn)也是無法檢測(cè)未知的融合[34-35]。

5 結(jié)語

BRAFV600E突變及KIAA1549-BRAF融合在不同膠質(zhì)瘤中發(fā)生率不同，而且檢測(cè)方法簡便，在膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后及治療等方面發(fā)揮重要作用。BRAFV600E突變?cè)贕G、PXA及上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等膠質(zhì)瘤中的高檢出率可以輔助膠質(zhì)瘤病理分型，同時(shí)對(duì)于兒童膠質(zhì)瘤的預(yù)后有一定提示意義。雖然目前BRAF抑制劑在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用僅有個(gè)案報(bào)道，但其為膠質(zhì)瘤的治療打開一條新的思路。KIAA1549-BRAF基因融合檢測(cè)不僅可以用于兒童低級(jí)別的膠質(zhì)瘤的診斷和鑒別診斷，也可用于與之相關(guān)機(jī)制的深入研究。