再造煙葉循環(huán)白水中細(xì)菌檢測方法的確立

王洪濤，吳 茜，劉肖肖，吳帥霖，陳 旭，李若雨，陳 云，李世朋

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004)

伴隨生態(tài)文明建設(shè)的推進(jìn)，提高水資源利用率已成為困擾造紙企業(yè)的一大難題.造紙法再造煙葉(Reconstituted Tobacco)的生產(chǎn)，沿用了造紙行業(yè)中相關(guān)的工序，生產(chǎn)過程水耗比較高.為了提高再造煙葉生產(chǎn)過程中資源的利用率，生產(chǎn)過程中的白水通常循環(huán)使用[1].隨著再造煙葉生產(chǎn)白水的循環(huán)使用，煙葉中可溶解的成分持續(xù)溶解于白水中，白水中營養(yǎng)物質(zhì)不斷富集，易導(dǎo)致白水產(chǎn)生異味、多粘性物質(zhì)的聚集、紙機(jī)出現(xiàn)斷紙的次數(shù)增加、生產(chǎn)效能的降低，甚至?xí)绊懏a(chǎn)品的感官品質(zhì)下降.

在造成白水中煙葉殘渣增多、水質(zhì)偏酸、氧化電位高的同時，有機(jī)污染物也容易引發(fā)微生物滋生，導(dǎo)致BOD(生物需氧量)和COD(化學(xué)需氧量)的含量增高[2-3]，不但降低了薄片的品質(zhì)，也降低了生產(chǎn)的效能.盡管有一些報道對白水的利用做了大量的研究工作，但大多都還沒有大面積推廣和應(yīng)用[4-5]，還需要做更深入和細(xì)致的工作.為了降低水耗、清潔生產(chǎn)、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量和改善生產(chǎn)環(huán)境，亟需對白水中的細(xì)菌數(shù)量、變化規(guī)律和種類進(jìn)行一系列的深入研究.因此，如何較為準(zhǔn)確地測定出白水中細(xì)菌的含量，就成為開展進(jìn)一步工作必須面對的首要問題.

本文綜合分析文獻(xiàn)資料，對常用的幾種檢測細(xì)菌的方法進(jìn)行初步的篩選和對比分析，結(jié)果顯示：濁度法、重量法和美蘭染色直接計數(shù)法檢測時間短，操作簡單，但由于易受到干擾物質(zhì)影響，一般適用于細(xì)菌的純培養(yǎng)體系；國標(biāo)采用的平板菌落計數(shù)法，其測定結(jié)果準(zhǔn)確性高，但只能檢測可培養(yǎng)的活細(xì)菌，且檢測時間較長；熒光法中的ATP熒光細(xì)菌計數(shù)法可檢測到各種來源的ATP，當(dāng)有污染(有機(jī)物或微生物)并非均勻地分布在產(chǎn)品接觸表面等情況時，無法區(qū)分不同來源的ATP而受到限制[6]；熒光法中的吖啶橙顯微計數(shù)法是利用吖啶橙(Acridine Orange, AO)作為熒光染料，其激發(fā)波長488 nm，發(fā)射光波長為515 nm，具有膜通透性，能夠穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞中的DNA和RNA結(jié)合，從而發(fā)出不同熒光，能夠同時檢測活細(xì)菌和衰亡細(xì)菌，操作簡便，檢測快速[7].本研究的目的是探索并優(yōu)化適用于白水細(xì)菌總數(shù)的檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：煙草薄片公司生產(chǎn)線網(wǎng)下工段同一地點的循環(huán)白水(RTCW)，每隔5 min取樣一次，連續(xù)取5個樣品.

試劑：牛肉膏(北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、蛋白胨(北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、瓊脂(北京索萊寶科技有限公司)、氯化鈉(北京索萊寶科技有限公司)、吖啶橙(Amresco 0360)、亞甲基藍(lán)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、聚乙烯吡咯烷酮(北京化學(xué)試劑有限公司)、甲醛(濃度為38%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、香柏油(中國上海懿陽儀器有限公司)，試劑均為分析純.

實驗所用水均為三蒸水，并經(jīng)過醋酸纖維素濾膜過濾，高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min后所得.

儀器：冰箱、分析天平、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高速分散器、高壓高溫滅菌器、精密天平、移液槍、生化培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、智能恒溫振蕩器、熒光顯微鏡、漩渦振蕩器、醋酸纖維素濾膜、黑色碳酸脂濾膜、一次性注射器.

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

0.2% 吖啶橙：分析天平稱取0.2 g吖啶橙粉末，精確至0.01 g，無菌水溶解，定容至100 mL.

1% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：分析天平稱取1 g聚乙烯吡咯烷酮粉末，精確至0.01 g，無菌水溶解，定容至100 mL.

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(BEPSM)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，用蒸餾水溶解，用5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為7.0，定容至1 000 mL，高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min.

呂氏堿性美藍(lán)染液：A液：亞甲基藍(lán)0.6 g，95%酒精30 mL；B液：KOH 0.01 g，蒸餾水100 mL；A液和B液混合.

1.2.2 平板菌落計數(shù)法[8]

參考國標(biāo)GB 4789.2-2010 菌落總數(shù)測定法測定.根據(jù)每個活的細(xì)菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的.取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，計算活菌數(shù).

1.2.3 濁度法[9]

參考文獻(xiàn)的方法，選擇最大吸收波長為600 nm光吸收的數(shù)值.比濁法是根據(jù)細(xì)菌懸液的透光量間接地測定細(xì)菌的數(shù)量.細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度.

1.2.4 重量法

此法分為濕重法和干重法.濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放入干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重.

1.2.5 美蘭染色直接計數(shù)法[10]

參考文獻(xiàn)的方法，將白水樣品中的細(xì)菌固定到載玻片上，進(jìn)行美蘭染色，脫色制片，在白光下使用100倍油鏡觀察計數(shù).

1.2.6 吖啶橙染色直接計數(shù)法[7]

參考文獻(xiàn)的方法，對樣品預(yù)處理、固定、顯色和計數(shù).吖啶橙溶液要求現(xiàn)配現(xiàn)用，并要求無菌濾器反復(fù)過濾至過濾無壓力為止.

2 結(jié)果與討論

2.1 白水中細(xì)菌檢測結(jié)果

2.1.1 常見測定方法使用范圍的比較

幾種常見細(xì)菌測定方法的情況對比，見表1.

表1 幾種常見的細(xì)菌檢測方法對比

由表1可以看出，基于待測樣品自身特點，篩選適合于白水中細(xì)菌的檢測方法，吖啶橙熒光顯微計數(shù)法可以滿足檢測的要求.基于ATP熒光檢測法測定的是ATP的存在量，對于組成復(fù)雜的白水體系，產(chǎn)生和消耗ATP的成分都比較復(fù)雜，干擾因素太多，故未列在表內(nèi).

2.1.2 濁度法與重量法的測定結(jié)果

依據(jù)濁度法、重量法測定白水中細(xì)菌數(shù)量的結(jié)果見表2.

表2 濁度法與重量法檢測結(jié)果

如表所示，采用濁度法、重量法檢測白水中細(xì)菌數(shù)值的重現(xiàn)性均較差.分析其主要原因是，在再造煙葉白水中含有大量的細(xì)小纖維和碳酸鈣[11]，這些輔料在600 nm的特定波長有較大的光吸收，會對測定細(xì)菌的吸光值(濁度法)產(chǎn)生較大影響，而這些細(xì)小纖維和碳酸鈣又難以進(jìn)行有效的分離，這些物質(zhì)在離心過程中隨著細(xì)菌一起被分離出來(重量法)，從而對檢測結(jié)果造成較大的干擾.由此可見，以測定細(xì)菌總數(shù)為目的的白水系統(tǒng)，微細(xì)纖維和生產(chǎn)輔料的混溶物嚴(yán)重干擾了細(xì)菌總數(shù)的測定，濁度法和重量法均不適合作為再造煙葉生產(chǎn)用白水細(xì)菌總數(shù)的測定方法.

2.1.3 美蘭染色顯微計數(shù)法的測定結(jié)果

白水樣品中細(xì)菌的美蘭染色顯微效果，如圖1所示.

(a)為白水中細(xì)菌顯微效果圖; (b)為單個染色點放大效果圖圖1 美蘭染色顯微圖Fig.1 Effect picture of methylene blue staining microscopic

結(jié)果表明，用美蘭染色顯微計數(shù)法無法進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù).主要原因可能是，美蘭染色時，染色的特異性不是很強(qiáng)[12]，白水中的可溶性物質(zhì)、固體顆粒、纖維狀物質(zhì)都可能吸附美蘭染料，從而形成片狀染色結(jié)果，對細(xì)菌計數(shù)造成較大干擾.因此，美蘭染色顯微計數(shù)法也不適合用于準(zhǔn)確的測定白水中細(xì)菌的數(shù)量.

2.1.4 國標(biāo)平板菌落計數(shù)法(FCCM)與吖啶橙染色直接計數(shù)法(AODC)的測定結(jié)果

取在冰箱存放1、38、58 d的白水以合適比例稀釋后，分別進(jìn)行國標(biāo)平板菌落計數(shù)法涂板和吖啶橙染色直接計數(shù)法染色，涂板和吖啶橙染色效果如圖2所示，放置時間分別為：(a) 1 d；(b) 38 d；(c) 58 d；(d) 1 d；(e) 38 d；(f) 58 d.

圖2 白水腐敗過程中菌落數(shù)與細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.2 Variations of CFU and total bacterium during RTCW decaying

國標(biāo)平板菌落計數(shù)法的檢測結(jié)果顯示，白水存放1、38和58 d時，菌落數(shù)分別為2.38×108、1.40×107和3.40×106個/mL(圖2a、b、c).檢測出的細(xì)菌數(shù)值隨著白水放置時間的延長，細(xì)菌數(shù)量在逐漸降低，這與白水放置期間細(xì)菌逐漸死亡，所?；罴?xì)胞逐漸減少呈現(xiàn)較好的對應(yīng)關(guān)系.但38和58 d時白水逐漸腐臭，表明國標(biāo)平板菌落計數(shù)法檢測的活菌總數(shù)無法真實地反映再造煙葉白水的質(zhì)量指標(biāo)，因而呈現(xiàn)表象樂觀的檢測結(jié)果.

有研究者指出，由于高濃度的營養(yǎng)基質(zhì)、無法實現(xiàn)原位培養(yǎng)、不明確環(huán)境中微生物之間的相互作用、缺乏尖端的微生物檢測方法等原因的影響，盡管微生物培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了幾十年，但是環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物比例仍然較低[13].景曉敏也發(fā)現(xiàn)，在用平板菌落計數(shù)法對生長、繁殖及死亡的動態(tài)微生物計數(shù)時，檢測結(jié)果不是很敏感[14].

吖啶橙染色直接計數(shù)法的結(jié)果表明，白水存放1、38和58 d時，細(xì)菌總數(shù)分別為1.57×109、6.47×109和8.40×109個/mL(圖2d、e、f).檢測出的細(xì)菌總數(shù)隨著白水腐敗程度加重而增加，能對白水腐敗程度起到重要的表征作用.這主要是由于吖啶橙與細(xì)胞中的核酸結(jié)合呈現(xiàn)橙紅色或綠色熒光，不易受細(xì)胞形態(tài)的影響[15]，可同時檢測出活菌和衰亡細(xì)菌，因而能夠比較真實地反映再造煙葉白水真實的細(xì)菌數(shù)量變化.

2.2 AODC檢測方法的優(yōu)化

上述的測定結(jié)果表明，吖啶橙染色直接計數(shù)法適合再造煙葉生產(chǎn)用白水細(xì)菌總數(shù)的檢測.為了更好的指導(dǎo)生產(chǎn)，本實驗對該檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化.

2.2.1 甲醛固定時間的優(yōu)化

如圖3所示，甲醛固定的時間分別為: (a) 0.5 min；(b) 1 min；(c) 2 min；(d) 3 min；(e) 5 min.

圖3 甲醛固定時間優(yōu)化圖Fig.3 Study of formalin fixation time

通過圖3可以看出，甲醛固定時間為2 min時可以滿足檢測需求. 5 min后細(xì)菌衰亡彌散，影響檢測.檢測方法最終選定甲醛固定時間為2 min.

2.2.2 吖啶橙染色時間優(yōu)化

如圖4所示，吖啶橙染色的時間分別為：(a) 5 min，(b) 10 min，(c) 15 min，(d) 20 min，(e) 25 min.

從圖4可以看出，吖啶橙熒光染色時間較短時，顯色反應(yīng)不明顯，染色>15 min，能在顯微鏡下觀察到比較清晰的熒光染色圖像，適合計數(shù)，因此，確定吖啶橙熒光染色的時間為15 min.

圖4 吖啶橙染色時間優(yōu)化圖Fig.4 Study of acridine orange staining time

2.3 AODC檢測方法的確定

白水是一個成分比較復(fù)雜的系統(tǒng)，它主要含有：無機(jī)鹽(碳酸鈣、氯化鈉等)、可溶性糖、蛋白質(zhì)、纖維素(可溶性、微晶和短小纖維素)等.其中短小纖維素對光吸收的干擾較大，使光吸收的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，而不能作為判斷指標(biāo)應(yīng)用于生產(chǎn)過程的檢測.另外，白水在循環(huán)使用過程中，其成分和含量在不斷的變化，光吸收數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，增加了用固定的光吸收數(shù)據(jù)來定量描述的難度.因此，用濁度法、重量法和美蘭染色直接計數(shù)法測定白水中細(xì)菌總數(shù)時干擾的因素較多，致使這些測定細(xì)菌數(shù)量的方法產(chǎn)生較大的偏差而不能使用，給準(zhǔn)確測定白水系統(tǒng)中細(xì)菌數(shù)量的工作增加了難度.由于白水中可培養(yǎng)的微生物比例仍然較低[13]，平板菌落計數(shù)法的測定也受到了限制[14].對于熒光顯色的ATP熒光檢測法[16]來說，因為它只適合于無任何其他來源ATP體系中細(xì)菌的檢測，在衛(wèi)生監(jiān)控中純粹以檢測微生物數(shù)量為目的來進(jìn)行ATP測試的做法是不可取的[6].吖啶橙熒光顯微計數(shù)法避免了白水體系中復(fù)雜成分的干擾，較好地表征出了白水中細(xì)菌數(shù)量的變化，表征細(xì)菌數(shù)量的特異性比較強(qiáng).

為了便于研究白水系統(tǒng)中細(xì)菌總數(shù)的變化規(guī)律，為生產(chǎn)和監(jiān)控等提供重要的依據(jù)，因此選定適于白水中細(xì)菌總數(shù)的測定方法是吖啶橙熒光顯微計數(shù)法，并經(jīng)過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定具體操作的步驟如下：

在超凈工作臺無菌的環(huán)境下，均勻混合待測樣品，吸取待測樣品1 mL在無菌的試管中，加入無菌水9 mL充分混勻后.按照同樣的操作，將該混合液選擇適當(dāng)?shù)奶荻冗M(jìn)行進(jìn)一步的稀釋.在顯微鏡下觀察，以每個視野中顯示20～200個細(xì)菌為最佳的稀釋比例.

取稀釋后的待測樣品適量于試管中，首先加入38%甲醛(控制終濃度約2.0%)，混勻反應(yīng)時間為2 min.再加入1%吖啶橙染色液(終濃度約0.01%)振蕩1 min混勻，染色反應(yīng)時間為15 min.用黑色碳酸脂濾膜過濾，并用無菌水清洗后再過濾，重復(fù)洗滌過濾操作三次.以10 mL無菌水代替樣品進(jìn)行同樣操作作為空白對照.

取下濾膜置于滴有香柏油的載玻片上，滴香柏油少許，放置蓋玻片，完成制片.

放置制片于油鏡下觀察，調(diào)整激發(fā)光在450～490 nm的范圍內(nèi)計數(shù)，在合適的視野范圍內(nèi)，選取大于15個視野分別計數(shù)，最后取其算術(shù)平均值為樣品的測定值.

統(tǒng)計測定結(jié)果，按以下公式代入計算，得到樣品中細(xì)菌總數(shù)的測定值.

N=K*Ns*S/(So*V)

其中：N:測定樣品的細(xì)菌總數(shù)，個/mL；

K：待測樣品的稀釋倍數(shù)；

Ns：視野中細(xì)菌的平均數(shù)，個；

S：過濾網(wǎng)膜面積，μm2；

So：觀察視野的面積，μm2；

V：過濾樣品量，mL.

綜上所述，吖啶橙染色直接計數(shù)法適應(yīng)于白水中細(xì)菌數(shù)量的測定.該方法的確定，為深入和細(xì)致的研究白水中細(xì)菌數(shù)量及其變化規(guī)律等一系列工作提供了有利的條件.

3 結(jié)論

1) 適應(yīng)于白水中細(xì)菌數(shù)量的測定方法是吖啶橙染色直接計數(shù)法，該測定方法耗時時間短，且特異性較好.

2) 吖啶橙染色直接計數(shù)法不僅可以測定繁殖能力強(qiáng)的細(xì)菌，還可以測定衰亡的細(xì)菌，適應(yīng)范圍更廣泛.

3) 該課題的進(jìn)一步研究可以為控制白水中細(xì)菌總數(shù)提供重要依據(jù)，對于食品安全的預(yù)警和生產(chǎn)安全指標(biāo)的調(diào)節(jié)和控制都具有深遠(yuǎn)的意義.