基于16S rRNA 技術(shù)分析石珍安神湯對脫髓鞘小鼠腸道菌群多樣性的影響

馬 超 賀 毅 孫作厘 劉鑫垚 馮正田 陳 沛 寧艷哲 朱 虹 尹冬青 賈竑曉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院 國家精神心理疾病臨床研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室，北京 100088； 2.首都醫(yī)科大學(xué)人腦保護高精尖創(chuàng)新中心，北京 100069)

精神分裂癥是臨床上常見的精神相關(guān)疾病，中國精神衛(wèi)生調(diào)查的數(shù)據(jù)[1]顯示，精神分裂癥的加權(quán)終生患病率為0.6%。精神分裂癥好發(fā)于青壯年，為其家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。從20世紀(jì)50年代氯氮平發(fā)現(xiàn)以來，精神分裂癥的治療以服用抗精神病類藥物為主，不過有1/5～2/5的患者有治療抵抗[3]。所以開發(fā)新的治療藥物至為關(guān)鍵。精神分裂癥的病因和發(fā)病機制尚不清楚，腸道微生物群可能通過“腦腸軸”在精神分裂癥發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[4]。腸道微生物群可通過免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)通路從而影響患者的大腦發(fā)育和行為[5]。最近，中醫(yī)藥治療菌群失調(diào)時得到了良好的治療效果[6]。石珍安神湯(Shi-Zhen-An-Shen-Tang,SZAST)是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合團隊的經(jīng)驗方，前期實驗[7]證明其可改善精神分裂模型小鼠社會交互行為及對少突膠質(zhì)細(xì)胞的低表達有治療作用。因此，通過腸道菌群多樣性來研究石珍安神湯(SZAST)治療精神分裂癥的作用機制，可為精神分裂癥的治療提供新的方向。

16S rRNA技術(shù)一種高通量測定方法，常用來檢測機體腸道菌群的多樣性序列[8]。16S rRNA技術(shù)已用于多種精神疾病的研究。一項有關(guān)自閉癥譜系(autism spectrum disorder, ASD)的研究[9]顯示，ASD的定植微生物群可導(dǎo)致自閉行為。有關(guān)帕金森病的研究[10-11]也表明帕金森病患者體內(nèi)的微生物群有別于正常健康對照組。腸道微生物群可能通過免疫和炎性反應(yīng)機制參與了精神分裂癥的發(fā)展[12-13]。為探討腸道菌群失衡與精神分裂癥的內(nèi)在聯(lián)系以及石珍安神湯在菌群治療、靶點研究中的作用和機制，本研究采取銅腙誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型，通過石珍安神湯治療，對小鼠回盲部糞便標(biāo)本中的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域進行定性分析。旨在從腸道微生態(tài)層面上探究該復(fù)方的作用機制，為臨床上精神分裂癥的評價與診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級5周齡的雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號: SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗環(huán)境清潔，晝夜交替 12 h，正常飲食。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:AEEI-2018-047)。

1.2 主要藥品

雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ) 購自美國 Sigma 公司; SZAST的各種單藥飲片購自北京同仁堂 (大柵欄店)，在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院制成凍干粉。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

實驗動物適應(yīng)2周后，采用數(shù)字表法隨機分為6組，每組 5 只，分別為：對照組(control, C)、模型組(model, M)、中藥低劑量組(low dosage,L)，中藥中劑量組(midium dosage, Z)，中藥高劑量組(high dosage, H)、喹硫平組(quetiapine, Q)。

對照組正常飲食，其他組食用混合了0.2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))CPZ的特殊飼料。食用特殊飼料4周后，模型組以 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液灌胃2周， SZAST組給予SZAST灌胃2周(SZAST的給藥劑量依次為5.5、11.0和16.5 g·kg-1·d-1)。喹硫平組按10 mg·kg-1·d-1喹硫平溶液灌胃，模型組灌胃給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(10 mg·kg-1·d-1)。每周測量1次小鼠體質(zhì)量。

1.3.2 樣品的制備

小鼠盲腸內(nèi)容物為機體菌群多樣性最為豐富的部位，末次給藥后用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛將小鼠麻醉，頸椎脫臼處死后立即取小鼠盲腸的內(nèi)容物，放入凍存管內(nèi)在液氮中速凍，-80 ℃ 超低溫冰箱保存。每組中隨機選取5個樣本送到北京華大基因公司進行腸道菌群多樣性檢測。

1.3.3 16S rRNA擴增子測序分析

采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組 DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的純度和濃度。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，使用細(xì)菌16S rRNA(V3-V4)區(qū)域引物,前引物為343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′，后引物為 798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′進行PCR純化和擴增。根據(jù)序列比對采用 pynast (v0.1)軟件對OTUs代表序列進行系統(tǒng)進化關(guān)系的構(gòu)建。測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，根據(jù)序列的相似性將序列歸為多個可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。參數(shù)為序列相似度大于或等于97%被歸為一個OTU單元。用QIIME 軟件包挑選出各個 OTU 的代表序列，并將所有代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。最終對數(shù)據(jù)信息進行alpha 多樣性，beta多樣性，菌群分類學(xué)組成及16S功能基因預(yù)測分析等一系列的綜合性分析及處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠菌群OTU分析

每組5個樣本進行分析得到OTU數(shù)據(jù)，利用花瓣圖的方式呈現(xiàn)。六個組別共有836個OTU，對照組獨有509個，模型組獨有511個，低濃度組獨有433個，中濃度組獨有473個，高濃度組獨有458個，喹硫平組獨有499個(圖1)。

圖1 各組腸道菌群的花瓣圖Fig.1 The flower plot intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.2 小鼠樣本菌群的alpha多樣性分析

2.2.1 各組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線

當(dāng)香農(nóng)指數(shù)為6時，各樣本從隨機抽取的測序條數(shù)發(fā)現(xiàn)的物種趨于飽和(圖2)。

圖2 各組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.2 Shannon of alpha diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.2.2 Good’s coverage指數(shù)

該指數(shù)反映測序深度，本實驗各樣本指數(shù)接近于 1，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種(圖3)。

圖3 各組樣本腸道菌群Good’s coverage指數(shù)Fig.3 Good’s coverage of alpha diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.3 小鼠菌群結(jié)構(gòu)beta多樣性分析

采用主成分分析(principal components analysis, PCA)考察小鼠腸道菌群 beta 多樣性的差異。與對照組比較， 模型組小鼠菌群明顯分開，表明兩組菌群結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。石珍安神湯低、中、高劑量組與喹硫平組均介于對照組與模型組中間(圖4)。

圖4 各組小鼠菌群beta多樣性的PCAFig.4 PCA of beta diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine; PCA:principal components analysis.

2.4 小鼠樣本菌群分類學(xué)組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門、綱、目、科、屬、種水平上最大豐度排名前15位的OTU，生成相對豐度柱形累加圖，以觀察各樣品在不同分類水平上，相對豐度較高的OTU及其比例，分析顯示，模型組的腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種及OTUs層次的菌群種類要少于對照組(圖5)。綱水平，與對照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌有 1個，β-變形菌(Beta-proteobacteria)(P<0.05)，且石珍安神湯中高濃度組可顯著回調(diào)該差異(P<0. 05)。目水平，與對照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌有1個，伯克菌目(Burkholderiales)，且石珍安神湯中高濃度組可顯著回調(diào)該差異(P<0.05)?？扑剑c對照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌有2個，產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)和擬桿菌科(Bacteroidales)(P<0.05)。屬水平，與對照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌有1個，毛螺菌屬-NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)，且給藥組可回調(diào)該差異(圖6)。

圖5 各組小鼠差異菌種的相對豐度Fig.5 Relative abundance of differences of species of intestinal flora in mice from each groupA:phylum; B:class; C:order; D:family; E:genus; F:species.

2.5 腸道菌群功能預(yù)測分析

通過PICRUSt(PhylogeneticInvestigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUSt)對OTU豐度表進行標(biāo)準(zhǔn)化，并且比對每個OTU的COG(Clusters of Orthologous Groups，COG)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)庫，獲得OTU對應(yīng)的COG家族信息和KEGG信息，從而計算他們的豐度以便進一步確定不同組別小鼠的腸道微生物組成的潛在功能變化。

圖6 各組小鼠本菌群具有顯著性差異菌群的相對豐度Fig.6 Abundance of bacteria with significant differences in intestinal flora of mice from each groupValues were expressed as mean ±SE(n=5,## P<0.01 vs control group; *P<0.05, ** P<0.01 vs model group);A: Beta-proteobacteria; B: Burkholderiales; C: Bacteroidales; D: Alcaligenaceae; E: Lachnospiraceae_NK4A136_group. C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine.

2.5.1 COG功能預(yù)測

在COG功能預(yù)測中，對照組和模型組中菌群功能的離散程度較大，且石珍安神湯給藥組與模型組離散程度大，而喹硫平給藥組接近對照組(圖7)。

圖7 各組COG功能預(yù)測圖Fig.7 The COG prediction of intestinal flora in mice from each groupCOG:clusters of orthologous groups; C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage.

2.5.2 KEGG功能預(yù)測

對照組和模型組中菌群功能的離散程度較大，且有個別較為突出，如對照組中二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素(stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol)的生物合成，類黃酮(flavonoid)生物合成較模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組中1,1,1-三氯-2,2-雙(4-氯苯基)乙烷(DDT)降解[1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) degradation ], β-半乳糖(betalain)生物合成, 吲哚生物堿(indole alkaloid)的生物合成的功能更顯著(P<0.05)。而石珍安神湯給藥組和喹硫平組對菌群功能的離散程度不大，在光合作用-觸角蛋白和鈣信號通路中與模型組差異較大(P<0.05)(圖8)。

3 討論

圖8 各組KEGG功能預(yù)測圖Fig.8 The KEGG prediction of intestinal flora in mice from each groupKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine.

精神分裂癥對應(yīng)著中醫(yī)的“癲狂證”，大多由痰淤結(jié)于心間引起。精神分裂癥致病機制復(fù)雜，致病因素多變，導(dǎo)致精神分裂癥有多種中醫(yī)辨證分型。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)石珍安神湯可調(diào)節(jié)脫髓鞘模型小鼠的腸道菌群并在相關(guān)通路中有治療作用，說明了SZAST在治療精神分裂癥時可能通過“微生物-腸-腦”軸發(fā)揮作用，并為抗精神病藥物的研制提供了新思路。

腸道菌群是腸道重要的組成部分，按比例和數(shù)量分布在腸道的不同位置且每個成年人擁有獨特的腸道微生物群組成。腸道菌群一般處于動態(tài)平衡中，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和代謝途徑中起著關(guān)鍵作用。如果腸道微生物群失衡則會導(dǎo)致一些生理疾病，例如胃腸道疾病、炎性腸病、肥胖和代謝疾病、癌癥、慢性肺病等[14]。還有研究[15]表明，腸道微生物群能夠通過“微生物群-腸道-大腦”軸來塑造大腦的生理甚至行為，是許多神經(jīng)精神疾病發(fā)展的關(guān)鍵觸發(fā)因素，導(dǎo)致類似精神疾病的生理和行為特征出現(xiàn)，例如自閉癥[9]、抑郁癥[16]等。也有研究[17]顯示，精神分裂癥患者血液中與微生物易位有關(guān)的血清學(xué)生物標(biāo)志物有所增加。事實上，微生物群與神經(jīng)元發(fā)育在童年和青少年時最活躍也是最脆弱的[18]，而精神分裂癥亦高發(fā)于青少年。

從結(jié)果看，石珍安神湯主要影響了變形菌綱、毛螺菌科和擬桿菌科。β-變形菌是革蘭陰性菌，是有害細(xì)菌。張雪等[19]發(fā)現(xiàn)在首發(fā)未用藥的精神分裂癥患者的糞便中變形桿菌是增高的。在本實驗中筆者觀察到模型組的變形菌的豐度值升高，而給藥組可回調(diào)模型組升高的變形菌。伯克菌目是β-變形菌綱的一個目，在本實驗中筆者觀察到模型組的伯克菌目的豐度值升高，而給藥組可降低模型組升高的伯克菌目。毛螺菌科是厚壁菌門梭菌目的革蘭弱陽性細(xì)菌，是短鏈脂肪酸產(chǎn)生屬，為小鼠腸道內(nèi)重要的細(xì)菌群落。Bordoni等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)帕金森動物模型的毛螺菌科的豐度也有下降。短鏈脂肪酸產(chǎn)菌屬比例下降改變腸道通透性，從而改變腸道駐留者條件致病菌(主要是變形桿菌)進入腸系膜淋巴或血液循環(huán)系統(tǒng)觸發(fā)周圍免疫炎性響應(yīng)[21]。在精神分裂癥患者的血液中觀察到有炎性因子的升高[22]，而在之前的脫髓鞘模型中證實了炎性反應(yīng)與脫髓鞘有關(guān)[23]。有研究[14]表明，擬桿菌門與陰性癥狀有關(guān)，有研究[24]顯示，在自閉癥兒童的糞便中有高豐度的擬桿菌。且細(xì)菌的高比例與抗結(jié)腸炎和低度全身炎性反應(yīng)有關(guān)[25]。本文研究結(jié)果表明，SZAST可回調(diào)減少的有益菌屬又可降低變形桿菌等有害菌屬的大量繁殖，說明該復(fù)方可從調(diào)節(jié)腸道菌群方面治療精神分裂癥。且中藥復(fù)方具有多靶點整體調(diào)節(jié)的特點，在精神分裂癥的藥物治療中有著獨特優(yōu)勢[26]。

綜上，筆者可得出腸道菌群失衡可能是脫髓鞘模型小鼠致病機制之一，石珍安神湯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性而改善脫髓鞘模型小鼠的異常行為。白質(zhì)損害是精神分裂癥的致病機制之一，該中藥復(fù)方可改善脫髓鞘模型小鼠的腸道菌群和異常行為，為精神分裂癥的臨床用藥提供新思路。不過，精神分裂癥致病機制復(fù)雜，如今仍沒有公認(rèn)的疾病模型。另外機體腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腸道菌群與精神分裂癥之間的因果關(guān)系還需要進一步研究。但本研究結(jié)果可能有助于理解精神分裂癥病因?qū)W中微生物組的作用，并有助于對精神分裂癥的微生物組進行針對性干預(yù)。