一點(diǎn)紅質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

康興東，周朝忠，張金良，毛金娣，胡吉忠，劉厚權(quán)

（1.江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100；2.江西省中藥消炎藥工程技術(shù)研究中心，江西 吉安 343100）

一點(diǎn)紅原收載于1977 年版《中華人民共和國藥典》[6]，但標(biāo)準(zhǔn)中僅做性狀檢查。此外在廣東等省的地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)中有收載，但無水溶性浸出物和含量測定項(xiàng)[7]。采集12 批一點(diǎn)紅藥材樣品，考察其顯微特征、TLC 薄層色譜特征、水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物等方面，并測定綠原酸含量，可為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和規(guī)范使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料、儀器與試藥

1.1 材料

試驗(yàn)所用一點(diǎn)紅藥材共12 批（其中，產(chǎn)地采集3批，藥材市場購買9 批），經(jīng)江西普正制藥股份有限公司吳永忠研究員鑒定為菊科一點(diǎn)紅屬植物一點(diǎn)紅〔Emilia sonchifolia（L.）DC.〕的干燥全草。其中，一部分樣用于顯微鑒定，另一部分樣品經(jīng)烘干粉碎（100目）后備用。具體信息見表1。

表1 一點(diǎn)紅樣品信息Table 1 Information

表1 一點(diǎn)紅樣品信息Table 1 Information

序號No.樣品來源Sample source 1 YDH1 廣西桂林Guilin,Guangxi Province 2 YDH2 四川成都Chengdu,Sichuan Province 3 YDH3 江西贛州Ganzhou,Jiangxi Province 4 YDH4 亳州藥材市場Bozhou Chinese medicine market 5 YDH5 亳州藥材市場Bozhou Chinese medicine market 6 YDH6 亳州藥材市場Bozhou Chinese medicine market 7 YDH7 亳州藥材市場Bozhou Chinese medicine market 8 YDH8 安國藥材市場Anguo Chinese medicine market 9 YDH9 安國藥材市場Anguo Chinese medicine market 10 YDH10 安國藥材市場Anguo Chinese medicine market 11 YDH11 安國藥材市場Anguo Chinese medicine market 12 YDH12 安國藥材市場Anguo Chinese medicine market編號Code

1.2 儀器設(shè)備

美國Waters1525-2489 型高效液相色譜儀；AUW 2200 十萬分之一電子分析天平（SHIMADZU 島津）；AB104-N 萬分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300 型超聲波清洗儀（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；SK160 Digital 生物顯微鏡（麥克迪奧光學(xué)儀器有限公司）；SX2-4-10 馬弗爐（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 試劑與試藥

綠原酸對照品（110753-200413）、一點(diǎn)紅對照藥材（121359-201504）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）、甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）、磷酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）、水（自制超純水）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 莖橫切面特征 表皮細(xì)胞一層，呈橢圓形或類方形，木化。棱角處可見木化的下皮細(xì)胞，一層。皮層狹窄，薄壁組織中含有較多棕色色素。維管束18～22 束，木質(zhì)部由導(dǎo)管、木薄壁細(xì)胞、木纖維組成，均木化。導(dǎo)管橢圓形或類圓狀多角形，直徑達(dá)60m。髓部寬廣，為橫切面的2/3，由大形薄壁細(xì)胞組成（圖1）。

圖1 一點(diǎn)紅莖橫切面Fig.1 Transverse section

圖2 一點(diǎn)紅粉末圖Fig.2 Powder diagram

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 對照藥材溶液的制備 取一點(diǎn)紅對照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲45 min，放冷，過濾，濾液蒸至約2 mL，作為對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過30 目篩）2 g，加甲醇50 mL，超聲45min，過濾，濾液蒸至約10 mL，加石油醚萃取3 次，每次15 mL，棄去醚液，余液蒸至約2 mL，作為供試品溶液。

3.2.5 發(fā)生銳器傷后上報(bào)率有待提高 調(diào)查顯示，發(fā)生銳器傷時(shí)，332名中每次上報(bào)的只有38.53%，經(jīng)常上報(bào)的只有22.06%，上報(bào)率很低。若上報(bào)了也只有36.47%的護(hù)士進(jìn)行血清學(xué)檢測，25%的護(hù)士注射了相關(guān)免疫疫苗。這一現(xiàn)象既暴露了醫(yī)院行政部門缺乏對社區(qū)護(hù)士職業(yè)防護(hù)的管理，也暴露了社區(qū)護(hù)士自我保護(hù)意識(shí)的淡薄，應(yīng)完善銳器傷上報(bào)制度，完善銳器傷的處理流程，加強(qiáng)培訓(xùn)和監(jiān)管，以利達(dá)到對職業(yè)暴露的控制與預(yù)防。

2.2.3 檢測方法 按薄層色譜法[8]試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各8L，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105 ℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。

2.3 水分、灰分和浸出物檢查

按2015 年版《中華人民共和國藥典》方法[8]測定，結(jié)果見表2，12 批一點(diǎn)紅中水分含量為10.0%～11.8%，平均值為10.9%；總灰分含量為8.2%～12.7%，平均值為10.5%；酸不溶性灰分含量為0.3%～3.0%，平均值為1.3%；水溶性浸出物含量為12.3%～18.2%，平均值為15.4%；醇溶性浸出物含量為11.0%～20.2%，平均值為15.4%。

圖3 不同批次一點(diǎn)紅TLCFig.3 Thin layer chromatography of different batches

表2 水分、灰分和浸出物含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of water,ash and extract content （%）

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 Diamonsil C18 柱（250 mm 4.6 mm，5m）；乙腈-磷酸-水（75∶2∶23）為流動(dòng)相；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；流量1 mL/min；進(jìn)樣10L。色譜圖見圖4。

圖4 綠原酸HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of chlorogenic acid

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品

2.24 mg，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過40 目篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50% 甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理60 min，取出，放冷，稱定重量，用50% 甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對照品2.24 mg，置50 mL 量瓶中，加50% 甲醇至刻度，搖勻，作為試驗(yàn)溶液。按色譜條件，分別注入1、2、5、8、10、15 和20L，測定峰面積。以進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：y=2 121 520x+17 575（r2=0.999 4），綠原酸為0.044 8～0.896 0g，峰面積與樣品含量具有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取綠原酸對照品溶液（44.8g/mL）10L，按照“2.4.1”項(xiàng)下的方法重復(fù)測定6 次，測得綠原酸峰面積RSD 為0.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液分別于0、1、2、3、5、8 和12 h，按照“2.4.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)樣測定，測得樣品中綠原酸峰面積RSD 為1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 回收率試驗(yàn) 取YDH12 的粉末6 份，每份約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含綠原酸對照品（濃度2.24g/mL）的50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，稱定重量，用50% 甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。按照“2.4.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)樣測定，計(jì)算得平均回收率為99.5%，RSD 為0.27%，結(jié)果表明本方法具有良好的回收率（表3）。

表3 綠原酸回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）Table 3 Test results of chlorogenic acid recovery rate （n=6）

2.4.9 樣品測定 取本品12 批，每批約1 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 一點(diǎn)紅藥材中綠原酸含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of chlorogenic acid in

表4 一點(diǎn)紅藥材中綠原酸含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of chlorogenic acid in

序號 No. 編號 Code 含量（%） Content 1 YDH1 0.037 6 2 YDH2 0.007 0 3 YDH3 0.189 6 4 YDH4 0.010 6 5 YDH5 0.028 3 6 YDH6 0.003 6 7 YDH7 0.016 3 8 YDH8 0.040 5 9 YDH9 0.037 3 10 YDH10 0.007 0 11 YDH11 0.040 1 12 YDH12 0.039 7

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層鑒別

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲提取和回流提取對供試品制備基本無差別，但超聲提取較方便，故選擇超聲提取。再進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，即對不同薄層板（自制硅膠G 板、預(yù)制硅膠G板）；展開系統(tǒng)（乙酸乙酯-甲酸-水=8∶1∶1、甲苯-醋酸乙酯-甲醇-甲酸=1∶8∶1∶1、乙酸乙酯-甲酸-甲醇=8∶1∶1）；點(diǎn)樣量（6、8、10L）；溫度（5、26 ℃）；濕度（25%、80%）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)該條件耐用性較好，相對濕度雖對斑點(diǎn)Rf有一定影響，但都能滿足試驗(yàn)要求；3種展開體系均能分離，但乙酸乙酯-甲酸-水=8∶1∶1的展開體系分離效果最好，斑點(diǎn)清晰。

3.2 水分、灰分、浸出物測定

參照2015 年版《中華人民共和國藥典》[8]方法，進(jìn)行了水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物樣品測定，其中醇溶性浸出物采用熱浸法，考察了不同醇濃度（50%、75%、95%乙醇）為浸出溶劑時(shí)的浸出物的量，結(jié)果顯示95%乙醇為浸出溶劑浸出效果最好，建議優(yōu)化浸出溶劑為95%乙醇，醇浸出物（熱浸法）不得少于12.0%。此外，感冒炎咳靈顆粒等制劑中一點(diǎn)紅為水煎煮提取，故建議增加一點(diǎn)紅水溶性浸出物標(biāo)準(zhǔn)，水溶性浸出物不得低于12.0%。

3.3 含量測定

紫外掃描顯示綠原酸在327 nm 波長處有最大吸收，故確定檢測波長為327 nm。再進(jìn)行方法學(xué)優(yōu)化，即對不同品牌色譜柱（Sun Flre C18 柱、Diamonsil C18 柱和依利特C18 柱）；提取溶劑（水、50%甲醇、70%甲醇和甲醇）；提取體積（50%甲醇15、25 和50 mL）和提取時(shí)間（超聲提取30、45 和60 min）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱對檢測結(jié)果無影響，并優(yōu)化確定采用50% 甲醇為提取溶劑、溶劑體積25 mL、超聲提取60 min 為供試樣品溶液制備方法。此外在線性范圍內(nèi)對高、低濃度取樣量的準(zhǔn)確度進(jìn)行考察，低濃度取樣量（綠原酸含量為0.405 mg/g 的樣品0.4 g）的平均回收率為96.4%（RSD=1.80%）；高濃度取樣量（綠原酸含量為1.896 mg/g的樣品0.9 g）的平均回收率為96.6%（RSD=1.21%），說明該方法在高、低濃度取樣量時(shí)的準(zhǔn)確度依然良好。